电子烟对去内皮SD大鼠肠系膜上动脉收缩的影响

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　　摘要：目的  探討电子烟代谢产物及其溶剂对去内皮Sprague-Dawley（SD）大鼠肠系膜上动脉（SMA）环收缩反应的影响。方法将溶剂（DMSO）、电子烟气溶胶提取物（ECAEs）、烟油溶剂[丙二醇（PG）和甘油（VG）]、烟碱体内主要代谢产物[N-亚硝基降烟碱（NNN）和亚硝胺酮（NNK）]、以及电子烟副产物丙烯醛（Acr）分别加入培养基孵育去内皮SD的SMA环24 h，观察不同浓度5-羟色胺（5-HT，10-10～10-4 mol/L）和苯肾上腺素（PE，10-10～10-4 mol/L）诱导的收缩反应。结果  DMSO、ECAEs对SMA环收缩反应无影响;丙二醇使5-HT诱导收缩的pD2值（SMA环收缩效应达到50%的时候所对应的收缩剂的浓度值）与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），甘油使PE（10-9～10-7  mol/L）浓度区间的收缩反应减弱（P<0.05）;NNN和NNK在100 μmol/L浓度下均可增强5-HT和PE诱导收缩反应的最大效应值Emax（P<0.05），且PE在10-5～10-4 mol/L剂量范围内可明显诱导SMA的收缩;丙烯醛培养的SMA环Emax值与对照组之间均有差异（P<0.01），5-HT和PE在10-5.5～10-4 mol/L剂量范围内诱导的收缩曲线均显著左移。结论  电子烟各类潜在危害因子24 h短期急性暴露可不同程度的增强去内皮SD大鼠肠系膜上动脉环的收缩反应，增强血管平滑肌的收缩反应。
　　关键词：电子烟;5-羟色胺;苯肾上腺素;肠系膜上动脉
　　中图分类号：TS458;R363                          文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.019
　　文章编号：1006-1959（2020）05-0062-05
　　Abstract：Objective  To investigate the effects of e-cigarette metabolites and their solvents on the contractile response of the superior mesenteric artery （SMA） ring in deendothelial Sprague-Dawley （SD） rats. Methods  Solvents （DMSO）， e-cigarette aerosol extracts （ECAEs）， e-liquid solvents [propylene glycol （PG） and glycerol （VG）]， and major metabolites in nicotine [N-nitrosonornicotine （NNN）] And nitrosamine （NNK）] and e-cigarette by-product acrolein （Acr） were added to the culture medium to incubate the SMA ring without SD in the endothelium for 24 h， and different concentrations of 5-HT （5-HT， 10-10～10-4 mol/L） and phenylephrine （PE， 10-10～10-4 mol/L） induced contractile response. Results  DMSO and ECAEs had no effect on the SMA ring contraction response; the pD2 value of 5-HT induced contraction by propylene glycol （concentration value of the contractile agent when the SMA ring contraction effect reached 50%） was statistically significant compared with the control （P<0.05）， glycerol weakened the contractile response of PE （10-9～10-7 mol/L） concentration range （P<0.05）;Both NNN and NNK can enhance the maximum effect value Emax （P<0.05） of 5-HT and PE-induced contractile responses at a concentration of 100 μmol/L， and PE can be obvious in the range of 10-5～10-4 mol/L Induction of SMA contraction; Emax values of SMA ring cultured in acrolein were different from those in the control group （P<0.01）， and the contraction curves induced by 5-HT and PE at a dose range of 10-5.5 to 10-4 mol/L were both moved significantly to the left. Conclusion  The short-term acute exposure of various potential hazards of e-cigarettes for 24 h can enhance the contractile response of the superior mesenteric artery ring of de-endothelial SD rats and the contractile response of vascular smooth muscle. 　　Key words：Electronic cigarette;5-hydroxytryptamine;Phenylephrine;Superior mesenteric artery
　　电子烟又名电子尼古丁传送系统，由电池、储液仓、烟弹和吸嘴组成[1]。通过电池加热使得烟油高温雾化吸入人体，以模仿吸食卷烟的过程。雾化产生的气溶胶化学组成与烟油化学组成不同，包括烟草特有的多环芳烃、亚硝胺、甲醛、乙醛和丙烯醛等有毒化合物的存在[2， 3]，对皮肤、眼睛和呼吸道等有着强烈的刺激作用[4]。据《2014年中国青少年烟草调查报告》显示，45.0%的初中学生听说过电子烟，1.2%的初中学生在过去30 d内使用过电子烟，且青年中使用电子烟的人数比例越来越大[5]。然而现阶段关于电子烟安全性评价的证据主要以观察性研究为主，尚缺乏足够的实验证据来说明电子烟对于人体的危害大小。5-羟色胺（5-HT）和苯肾上腺素（PE）是两种强血管收缩剂。5-HT通过几种不同类型的受体作用于胃肠道、外周血管和大脑调节系统[6]，同时还是一种强平滑肌收缩刺激剂。PE又称去氧肾上腺素，激动α受体时有明显的血管收缩作用，增加外周血管阻力，升高收缩压和舒张压。本实验拟观察电子烟气溶胶及其气溶胶中的化学物质短期急性暴露对去内皮SD大鼠离体SMA收缩反应的影响，初步探究其对于血管平滑肌上5-HT受体和PE受体的影响，以期为电子烟的安全性评价提供参考。
　　1材料与方法
　　1.1电子烟气溶胶提取物（ECAEs）制备  在①～③号U型玻璃多孔吸收管中分别加入2、2、1 ml 二甲基亚砜（DMSO），储液仓刻度线以上加入500 μl烟油。打开大气采集器（④），调整流速为0.6 L/min，稳定2 min后抽吸电子烟（⑤）3.5 s，间歇30 s的频率重复抽吸[8]，直至500 μl电子烟消耗至刻度线停止，将U型玻璃多孔吸收管中的吸收液倒出定容至5 ml，-20℃保存，见图 1。
　　1.2试剂  DMSO购自MP Biomedicals，France。DMEM低糖培养基、双抗（Penicillin-Streptomycin Solution）均购自Life Sciences， USA。N-亚硝基降烟碱（NNN）购自Augsburg， Germany。4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、曲拉通（Triton X-100）、5-HT、PE和乙酰胆碱（Ach）均购自Fluka/Sigma-Aldrich，USA。1，2-丙二醇（HPLC，99.5%）、甘油（HPLC，99.5%）和丙烯醛（GCS，≥99.5%）均购自北京北方伟业计量技术研究院商城分院。原萃烟油（12 mg/ml nicotine）购自Sky Throne Ltd，United Kingdom。PSS（NaCl 119 mmol/L， KCl 4.6 mmol/L， NaHCO3 15 mmol/L， NaH2PO4 1.2 mmol/L， MgCl2 1.2 mmol/L， CaCl2 1.5 mmol/L and glucose 5.5 mmol/L） ，KPSS为  60 mmol/L KCl等量替换PSS溶液中的NaCl。
　　1.3分组与处理  雄性SD大鼠（300～350 g）购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号SCXK（川）2015-030。大鼠在SPF级实验动物中心喂养，自由饮水，饲以普通动物饲料。本实验研究经西安医学院伦理委员会批准。实验分组为DMEM和DMSO对照组，以及ECAEs组、VG组和PG组、NNN组和NNK组、Acr组为实验组。每组至少使用4只SD大鼠，每只SD大鼠的SMA都剪成8个环段，每两个环段接受相同药物和浓度的处理，直至每组的SMA有效环段数n≥6即可统计。
　　1.4组织准备与培养  适应性喂养3 d后开始试验，大鼠使用CO2安乐死后在解剖显微镜下迅速取出SMA置于预冷PSS缓冲液中，使用0.1% Triton X-100灌注血管10 s，再用PSS缓冲液灌注血管2次，以去除内皮细胞。将血管剪成2～3 mm长短的环段置于37℃，5%CO2，95%空气的湿润条件，加入青霉素（100 U/ml），链霉素（100 mg/ml），再分别加入不同浓度的DMSO、ECAEs、VG、PG、NNN、NNK、Acr于低糖DMEM培养基中培养24 h。
　　1.5功能試验  将培养后的血管环段固定在微血管张力检测仪（Organ Bath Model700MO，J.P. Trading， Aarhus，Denmark）的L型针上，在浴槽中加入5 ml预热至37℃的PSS缓冲液，并持续通入O2以维持pH为7.4，每20 min更换1次PSS。使用LabChart 7 Pro software（AD Instruments，Hastings，UK）连续记录血管张力变化值。逐步调节SMA静息张力为2 mN，维持至少2 h使血管达到稳定。随后使用富钾（60 mmol/L K+）生理盐缓冲液KPSS诱导血管收缩，重复2次求平均值作为血管收缩参考值。使用10-5 mol/L Ach检测内皮完整性，血管无舒张或舒张程度<30%且当血管张力增长>1 mN则可以使用该血管环段。采用浓度累积的方式将5-HT和PE按照10-10、10-9.5、10-9......10-4 mol/L的浓度梯度分别加入不同浴槽中，记录两种收缩剂诱导的收缩反应及SMA环收缩效应达到50%的时候所对应的收缩剂的浓度值（pD2值）。
　　1.6统计学方法  采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据以（x±s）表示，两组比较采用Graphpad prism 6双侧Student-t检验，多组间比较采用单因素LSD方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。 　　2结果
　　2.1电子烟代谢产物及溶剂对5-HT、PE诱导的去内皮SMA收缩量效曲线的影响
　　2.1.1 DMSO及ECAEs对去内皮SMA收缩反应的影响  不同浓度DMSO（1 μl/ml和5 μl/ml） 孵育SMA环24 h后不影响5-HT与PE诱导SMA环的收缩反应，见图2A。不同浓度的ECAEs 0.2 μl/L和0.4 μl/L孵育SMA环24 h后也不影响5-HT与PE诱导SMA环的收缩反应，见图2B。
　　2.1.2 NNN和NNK对去内皮SMA收缩反应的影响   NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L浓度可使5-HT诱导的收缩曲线在5-HT 累积到10-5 mol/L时开始左移，见图2Ca、图2Cc。使用NNN 100 μmol/L浓度孵育SMA环可浓度依赖性增强PE诱导的收缩反应，使量效曲线左移，在PE（10-9～10-7.5mol/L和10-5～10-4mol/L）浓度区间与对照组比较，统计学意义显著（P<0.01），见图2Cb。NNK 100 μmol/l浓度孵育SMA环24 h后使PE诱导的收缩曲线显著左移，在PE（10-5.5～10-4mol/L）浓度区间与对照组比较，统计学意义显著（P<0.01），见图2Cd。
　　2.1.3 PG和VG对去内皮SMA收缩反应的影响  不同浓度的丙二醇PG（62.5 μg/ml和250 μg/ml）和甘油VG（0.02 g/ml和0.04 g/ml）孵育SMA环24 h，在5-HT诱导的收缩下可使量效曲线左移，但与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图2Da、图2Dc。PG 62.5 μg/ml孵育SMA环24 h后在PE   （10-9～10-7mol/L）浓度区间和PG 250 μg/ml孵育SMA环24 h后在PE（10-8.5～10-7.5mol/L）浓度区间与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），量效曲线右移，见图2D b。由VG孵育后不影响经PE诱导的SMA环的收缩反应 ，见图2D d。
　　2.1.4丙烯醛对去内皮SMA收缩反应的影响  不同浓度的丙烯醛Acr（50 μmol/L和100 μmol/L）孵育SMA环24 h后均浓度依赖性的增强由5-HT和PE诱导的收缩反应，量效曲线均显著左移（P<0.01）。且Acr（50 μmol/L和100 μmol/L）均在PE（10-5.5～     10-4 mol/L）浓度区间与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图2E。
　　2.2电子烟代谢产物及溶剂对5-HT、PE诱导去内皮SMA收缩反应Emax值和pD2值的影响
　　2.2.1 DMSO及ECAEs对SMA收缩反应Emax值和pD2值的影响  不同浓度的DMSO和ECAEs对5-HT、PE诱导去内皮SMA收缩反应的Emax值和pD2值均无影响，差异无统计学意义（P>0.05），且在DMSO 1 μl/ml和5 μl/ml浓度由K+诱导的收缩反应与空白DMEM组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1、表2。
　　2.2.2 NNN和NNK对SMA收缩反应Emax值和pD2值的影响  NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L浓度孵育SMA环24 h，可使5-HT诱导的收缩曲线Emax值與对照组DMSO 1 μl/ml比较，差异有统计学意义（P<0.05）。NNN 100 μmol/L孵育SMA环24 h还可使pD2值增大，与DMSO 1 μl/ml组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。NNN 100 μmol/L和NNK 100 μmol/L浓度孵育SMA环24 h也可使PE诱导的收缩曲线Emax值与对照组DMSO 1 μl/ml比较，统计学意义显著（P<0.01），但不影响pD2值，见表2。
　　2.2.3 PG和VG对SMA收缩反应Emax值和pD2值的影响  不同浓度PG和VG对5-HT、PE诱导去内皮SMA收缩反应的Emax值均无影响，差异无统计学意义（P>0.05），见表1、表2。但PG 250 μg/ml和VG 0.02 g/ml浓度可增强5-HT诱导收缩的pD2值，与DMEM组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2.4 Acr对SMA收缩反应Emax值和pD2值的影响  Acr 50 μmol/L和100 μmol/L浓度孵育SMA环24 h可使5-HT和PE诱导的收缩曲线Emax值均与对照组DMSO 1 μl/ml比较，统计学意义显著（P<0.01），但对pD2值没有影响，见表1、表2。
　　3讨论
　　电子烟气溶胶的主要成分有甘油和丙二醇，这种吸湿高渗性的气溶胶可沉积在肺部深处，减缓人支气管上皮细胞的代谢[8]，降低原代人支气管上皮细胞的细胞活力[9]，提高促炎标志物（MCP-1，IL-6，IL-8）的水平[10]，这些炎症因子可诱导气道上皮的损伤。气溶胶中的烟碱与环境中的亚硝酸（HONO）反应形成致癌的烟草特有的亚硝胺（TSNAs）类物质NNN和NNK，其中尼古丁的转化率高达0.4%，属于IARC 1类致癌物[2，11，12]。而丙烯醛（IARC 3类致癌物）则是甘油（VG）和丙二醇（PG）在高温加热时产生的热脱水产物。作为一种刺激性的强氧化剂[13]，可直接作用于肺部，增强氧化应激，引起机体大分子的损伤（DNA，脂质和蛋白质）[4]。丙烯醛的慢性吸入抑制内皮祖细胞的循环促进了动脉粥样硬化，使主动脉硬化速度加快1.6倍;另据研究报道当电子烟的电压由3.3 V变为4.4 V时，醛类物质产生3倍以上，丙烯醛排放量增加10倍;电子烟通过高电压电池作用排放醛类化合物的含量甚至可能超过传统卷烟产生的排放量[13，14]。 　　本研究结果显示，NNN和NNK提高了5-HT诱导收缩曲线的Emax值，pD2值也提示NNN对于5-HT受体的亲和力的增强。NNN和NNK还使PE诱导的SMA环收缩曲线均显著左移且增强了收缩反应的Emax值。气溶胶中的丙烯醛使5-HT和PE诱导的收缩曲线显著左移和收缩反应Emax值显著增强，该现象可能由5-HT受体或α受体数量增多  或与相应受体结合能力增强所致。烟油主要成分   甘油和丙二醇使5-HT诱导的收缩曲线与DMSO   1 μl/ml组无明显差异，但是二者可使5-HT诱导收缩反应的pD2值均显著增强。而ECAEs却没有对肠系膜上动脉产生影响，其原因可能由于气溶胶中与烟草烟雾相比，其有毒成分的含量通常低得多，并且短期暴露对于肠系膜上动脉也可能不会产生影响。NNN和NNK等混合着丙烯醛、甘油和丙二醇等有毒化合物形成的电子烟气溶胶，长期作用会对心血管系统造成不良的影响，成为心血管疾病发生的危险因子。本研究通过动物体外实验证实电子烟气溶胶中的一些成分确实会对去内皮的大鼠肠系膜上动脉平滑肌的收缩功能有所影响，然而短期体外实验不能充分解释电子烟气溶胶中成分引起血管收缩增强的原因，后期将通过长期染毒实验对电子烟的安全性评价提供更充分地证据。
　　综上所述，电子烟气溶胶中的一些成分增强去内皮大鼠肠系膜上动脉的收缩功能，增强了5-HT受体和α受体与电子烟气溶胶成分的结合力和效应表达，本研究为电子烟安全性评价提供了新的证据。
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　　收稿日期：2019-11-28;修回日期：2020-01-17
　　編辑/肖婷婷
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