关于BCCIP与P53相互作用的研究

来源:用户上传      作者:刘昱彤

　　摘 要：BCCIP是一个与BRCA2和p21相互作用的蛋白质，在众多细胞进程中具有重要作用。p53是一种重要的肿瘤抑制基因，也是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。本文通过引入P53基因来研究BCCIP抑制肿瘤的生物学功能，验证BCCIP与P53之间的蛋白相互作用关系。
　　关键词：转录调控;BCCIP;P53;抑癌基因;蛋白质与蛋白质相互作用;表观遗传学
　　BCCIP是一个与BRCA2和p21相互作用的蛋白质。作为一种新近克隆成功的抑癌基因，BCCIP是细胞生存、基因稳定不可缺少的基因，该蛋白在胚胎发育、细胞周期调控、细胞有丝分裂、DNA同源重组（HR）以及保持基因组稳定性等众多细胞进程中都具有重要作用[1]。截至到目前的研究，在Bio GRID数据库记录的BCCIP相互作用蛋白有50多种，功能涉及多种细胞生物学过程，预示着BCCIP蛋白在更多方面的功能还有待进一步研究。有研究表明，BCCIP基因在乳腺癌、脑神经胶质瘤、喉癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌等组织中的表达量均有降低或不表达[2]，提示BCCIP与这些肿瘤的发生相关，也进一步证实了BCCIP可能为一个重要的抑癌基因。
　　为了进一步探讨BCCIP的功能和作用机制，我们将研究BCCIP与P53之间相互作用的关键性结构域以揭示BCCIP在肿瘤中发挥的功能。因此，我们引入P53基因来研究BCCIP抑制肿瘤的生物学功能。已有研究证实，BCCIP通过调节p53的转录活性，减少p53四聚体的形成，阻止p53与它的靶基因p21和HDM2的增强子结合。目前P53对P21的调控作用已有充分的研究，我们将着重研究BCCIP对P53的调控作用。在前期数据的基础上，为了进一步阐明BCCIP与P53之间的蛋白相互作用位点，本文拟设计实验：构建BCCIP的真核和原核的表达载体，通过Co-IP和GST pull down等技术找出BCCIP与P53相结合的具体结构域。
　　1 材料与设备
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 主要化学试剂
　　乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回DNA收试剂盒、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、D2000 plus DNA ladder、DL500 DNA marker、預染蛋白Marker SM0671、胎牛血清。
　　1.1.2 常用试剂成分
　　（1）LB液体培养基（1L）：10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，调pH至7.4，高压蒸汽灭菌。
　　（2）LB固体培养基（1L）：LB液体培养基中加入15g琼脂粉。
　　（3）SOC培养基（1L）：20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2ml 5M NaCl，2.5ml 1M KCl，10ml 1M MgCl2，10ml 1M MgSO4，20ml 1M葡萄糖。
　　（4）Amp抗生素：1克Amp，10ml蒸馏水，浓度100mg/ml。
　　（5）DMEM培养基（1L）：一包粉末DMEM培养基，800ml水，2g NaHCO3，10%血清。
　　（6）磷酸缓冲体系（PBS）（1L）：NaCl 137mmol/L，KCl 27mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。用浓盐酸调pH为7.4。
　　（7）胰酶：0.25g胰酶，100mlPBS，调PH为7.4。
　　（8）50×TAE buffer（1L）：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）100ml。
　　（9）6×loading buffer（DNA电泳）：30mM EDTA，36%（V/V）甘油。
　　（10）10×湿转transfer buffer（1L）：Tris 14.4g、甘氨酸3.02g、甲醇100ml。
　　（11）4×SDS-PAGE Loading Buffer（1L）：量取1M Tris-HCl 10ml，称取4g SDS，200mgBPB，20ml甘油。
　　（12）PBS（1L）：1ml双抗+999ml PBS。
　　1.2 实验设备
　　低温保存箱、药品保存箱、-80℃冰箱、-40℃冰箱、PCR仪、恒温卧式摇床、紫外分光光度计、超声破碎仪、凝胶成像系统、电泳仪电源、水平电泳槽、迷你离心机、超净工作台、垂直混合器、低速离心机、可见光分析灯箱、恒温培养箱、双垂直蛋白电泳仪、台式离心机、电子天平、涡旋混匀器、琼脂糖凝胶电泳仪、洗片机、超纯水机、制冰机、磁力搅拌器、脱色摇床。
　　2 实验思路与方法
　　2.1 实验研究思路
　　首先我们根据BCCIP和P53的蛋白结构域特征，分别构建了BCCIP和P53的不同截短真核表达质粒，然后在HCT116细胞中共转BCCIP和P53的不同截短质粒，通过COIP实验和免疫印迹检测技术，确定BCCIP与P53相互作用的具体结构域。而后在HCT116细胞中瞬转一定量的P53全长表达质粒和梯度剂量的BCCIP全长表达质粒，通过Western blot检测BCCIP对P53蛋白的稳定性的影响;再用同样的方法瞬转不同的截短表达质粒，检测BCCIP对P53相互作用结构域的稳定性影响，进而揭示BCCIP对P53的调控以及在癌症中的生物学功能。
　　2.2 实验研究方法
　　2.2.1 质粒构建
　　（1）设计BCCIP和P53的截短质粒引物，PCR选择最佳退火温度。（2）DNA电泳并做胶回收。（3）目的片段连接T载体。（4）大肠杆菌转化，蓝白斑筛选，挑菌。（5）PCR检测，选择电泳条带正确的菌株进行小提。（6）送公司进行测序。（7）将连T的Insert和载体分别进行大切胶回收（先小切进行验证）。（8）Insert与Vector连接。（9）质粒转化，挑菌。（10）菌液PCR选取条带位置正确的菌液进行小提。（11）送公司进行测序。 　　2.2.2 真核表达质粒Co-IP实验
　　（1）在HCT116細胞中共转BCCIP和P53的表达质粒。（2）瞬转48小时后收细胞，RIPA裂解液4度裂解6小时。（3）12000rpm，4度，离心1小时，收集裂解后上清。（4）平衡beads，beads与细胞裂解液孵育过夜进行结合。（5）洗脱非特异蛋白，做样，western blot检测。
　　3 实验结果分析
　　在细胞周期调控中，目前发现BCCIP通过3个途径调节p21蛋白;在同源重组修复中，BCCIP除了通过BRCA2-RAD51蛋白通路外，还可能通过p21蛋白参与细胞周期和细胞周期检查点的调节进而影响同源重组修复[3];在维持基因组稳定性方面，BCCIP下调引起细胞分裂中期染色体断裂和姐妹染色单体交联，从而影响细胞的有丝分裂，抑制细胞的增值。
　　One等[4]发现BCCIPα的161-259氨基酸区域与p21的C端149～164氨基酸和CDK2结合后形成三聚体。BCCIPα的过表达通过增强p21抑制CDK2组蛋白H1激酶活性的能力以达到抑制细胞增殖的目的。Meng等[5]发现在细胞内BCCIPβ与p21相互作用可以抑制细胞的生长，并且p21蛋白下调的细胞阻断部分其抑制细胞生长的功能。用RNA干扰技术抑制BCCIP基因表达可引起p21蛋白水平下调，并且使HT1080细胞G1/S周期检查点对电离辐射应答的功能受损。而过表达BCCIPα或BCCIPβ引起p21mRNA水平和蛋白表达的升高，延迟细胞的G1/S期。而增加p21蛋白的稳定性并不会引起BCCIP过表达对P21的影响。p21是p53下游的靶基因，p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，该基因有一半以上的概率发生突变。研究者推测p53可能与BCCIP对p21的调节相关，接下来的研究发现沉默p53基因表达后，BCCIP过表达不再引起p21水平升高，说明p53是BCCIP诱导p21表达的关键因素[6]。进一步研究发现，BCCIP对p53的转录活性起着关键的作用，在p53野生型细胞，p53蛋白水平不会因BCCIP蛋白的下调而变化，但是会引起p53转录活性的降低，减少p53四聚体的形成，阻止p53与它的靶基因p21和HDM2的增强子结合[7]。
　　本实验根据BCCIP和P53的蛋白结构域特征，分别构建了BCCIP和P53的不同截短真核表达质粒;先用带GFP荧光质粒瞬转以测其瞬转效率，证明其瞬转效率没有问题，然后在HCT116细胞中，通过瞬转本实验构建的质粒。我们检测到质粒在HCT116细胞中瞬转均表达，构建成功;再通过CO-IP实验和免疫印迹检测技术，验证了BCCIP与P53之间的蛋白相互作用关系，进一步论证了BCCIP蛋白会影响DNA损伤的重组修复，G1/S细胞周期调控，细胞有丝分裂和基因组稳定性，这些都说明BCCIP与肿瘤的发生和肿瘤的治疗有着密不可分的关系。
　　参考文献：
　　[1]邱斌.BCCIP在非小细胞肺癌中的研究[D].北京：中国协和医科大学，2006.
　　[2]刘晓霞，刘超英，李晓辕，等.BCCIP在卵巢恶性肿瘤的表达及临床意义分析[J].中国免疫学杂志，2012（3）：213-216.
　　[3]Meng X，Liu J，Shen Z.Genomic structure of the human BCCIP gene and its expression in cancer[J].Gene，2003，302（1-2）：139-46.
　　[4]Ono T，Kitaura H，Ugai H，et al.TOK-1，a novel p21Cip1-binding protein that cooperatively enhances p21-dependent inhibitory activity toward CDK2 kinase[J].J Biol Chem.2000，275（40）：31145-54.
　　[5]Meng X，Liu J，Shen Z.Inhibition of G1 to S cell cycle progression by BCCIP beta[J].Cell Cycle，2004，3（3）：343-8.
　　[6]Meng X，Lu H，Shen Z.BCCIP functions through p53 to regulate the expression of p21Waf1/Cip1[J].Cell Cycle，2004，3（11）：1457-62.
　　[7]Meng X，Yue J，Liu Z，Shen Z.Abrogation of the transactivation activity of p53 by BCCIP down-regulation[J].J Biol Chem，2007，282（3）：1570-6.
　　基金：吉林大学2019年省级大学生创新创业项目（项目编号：201910183791）
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15204911.htm