云南汉族非综合征性唇腭裂与p53基因多态性的相关性研究

来源:用户上传      作者:邵帅 张莉 刘华

　　[摘要]目的：分析p53基因单核苷酸多态性（SNPs）位点的多态性，探究云南汉族非综合征性唇腭裂与p53基因的相关性。方法：选取2016年1月-2018年12月于笔者医院就诊的非综合征性唇腭裂患儿100例为试验组，选取医院同期无先天性畸形正常患儿100例为对照组。采用Taqman探针荧光定量PCR法对p53基因的SNPs位点rs12947788和rs1042522进行基因分型，并用χ2检验和Logistic回归分析多态位点与非综合征性唇腭裂的相关性。结果：p53的基因SNPs位点rs12947788的等位基因变体A携带者（AA+GA vs GG）发生非综合征性唇腭裂的风险增加（OR=1.393，95%CI 1.030～1.884，P=0.032）。rs1042522（CC vs CG+GG）增加吸烟者母亲生下NSCL/P患儿的风险（OR=2.561，95% CI=1.146～5.721，P=0.022）。rs12947788（AA+GA vs GG）可明显增加有饮酒史母亲（OR=3.235，95%CI=1.158～9.040，P=0.025）生下NSCL/P患儿的风险。结论：云南汉族人群非综合征性唇腭裂与p53基因rs1042522、rs12947788多态具有一定的相关性。
　　[关键词]非综合征性唇腭裂;抑癌基因p53;基因多态性;相关性
　　Abstract： Objective  The single nucleotide polymorphism （SNPs） of p53 gene was analyzed to explore the correlation between p53 gene and non-syndromic cleft lip and palate of han nationality in yunnan province. Methods  A total of 100 children with non-syndromic cleft lip and palate admitted to our hospital from January 2016 to December 2018 were selected as the experimental group， and 100 children without congenital malformation during the same period in our hospital were selected as the control group. Taqman probe fluorescence quantitative PCR was used to genotype p53 SNPs sites rs12947788 and rs1042522， and the correlation between polymorphism sites and non-syndromic cleft lip and palate was analyzed by χ2 test and logistic regression. Results  Carriers of allele A of p53 SNPs rs12947788 （AA+GA vs GG） have an increased risk of developing non-syndromic cleft lip and palate （OR=1.393， 95%CI 1.030～1.884， P=0.032）. Rs1042522 （CC vs CG+GG） increased the risk of NSCL/P in children born to mothers of smokers （OR=2.561， 95% CI=1.146～5.721， P=0.022）. Rs12947788 （AA+GA vs GG） significantly increased the risk of NSCL/P in children born to mothers with drinking history （OR=3.235， 95%CI=1.158～9.040， P=0.025）. Conclusion  There is a certain correlation between non-syndromic cleft lip and palate and p53 gene rs1042522 and rs12947788 polymorphism in yunnan han population.
　　Key words： nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate（NSCL/P）; tumor suppressor gene p53; gene polymorphism; garrelation
　　非綜合征性唇腭裂唇腭裂（Nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是临床外科最常见的先天性出生缺陷之一，指不伴发其他系统器官畸形的不属于任何综合征性唇腭裂的唇裂、腭裂的总称[1-3]。非综合征性唇腭裂在世界范围内发病率约为1‰～2‰[4]，中国地区的发病率约为1.42‰[5]，位列我国新生儿出生缺陷病第2位，具有明显的种族和地域差异。NSCL/P是一种由多种因素造成的复杂疾病，学者们一般都认为是基因和环境共同作用下的结果，与妊娠期吸烟[6]、符合维生素补充[7]、饮酒[8]以及基因多态性[9]等因素密切相关。目前有大量关于基因多态性与非综合征性唇腭裂相关的研究，干扰素调节因子-6（Interferon regulatory factor-6，IRF-6）基因和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因是学者们最主要的研究对象[10-11]。p53基因是最早发现的人体抑癌基因中的一员，与人类恶性肿瘤关系密切，在人体发生恶性肿瘤时，50%以上的概率会出现p53基因的突变[12]。有研究表明[13-14]，p53基因突变与多种系统性疾病有关。目前还没有关于p53基因与非综合征性唇腭裂相关性的研究，考虑到非综合征性唇腭裂与基因多态性因素的密切联系，本研究通过观察分析p53基因的SNPs位点rs12947788和rs1042522的基因分型，来探究p53基因与非综合征性唇腭裂的相关性关系，以期为临床疾病预测提供可靠理论依据。 　　1  资料和方法
　　1.1 研究對象：随机选取2016年1月-2018年12月于笔者医院就诊的非综合征性唇腭裂患儿100例为试验组，选取医院同期正常无先天性畸形正常患儿100例为对照组。试验组患儿男性53例，女性47例，平均年龄为（1.41±1.19）岁;对照组患儿男性51例，女性49例，平均年龄为（1.48±1.32）岁。两组研究对象之间性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。两组所有患儿均为居住于云南地区彼此无血缘关系的汉族个体。研究对象母亲饮酒史定义为每天至少50g，持续时间至少1年;吸烟史定义为每天至少1根，持续时间至少1年。家属均签署知情同意书，本试验通过医院伦理委员会审查。
　　纳入标准：①试验组患儿由医院3名口腔颌面外科唇腭裂专科医师共同诊断为非综合征性唇腭裂;②除非综合征性唇腭裂外无其他先天性畸形;③两组患儿的直系血亲为至少三代长期定居于云南境内的汉族人群。
　　排除标准：①少数民族患儿;②伴有其他系统器官的先天性畸形;③非综合征性唇腭裂诊断存在争议的患儿。
　　1.2 p53基因多态性位点的选择：根据p53基因多态位点在我国人群中的频率分布，并结合相关文献中关于p53基因多态性与其他疾病相关性的报道，且未在非综合征性唇腭裂相关疾病中报道过的p53多态位点作为研究对象。最终选择rs12947788和rs1042522作为本研究的多态位点，探讨这两个多态位点与非综合征性唇腭裂疾病的相关性关系。
　　1.3 基因的提取与SNP位点基因分型：①采集两组患儿的空腹静脉血5ml（用EDTA.K2或肝素抗凝），置于2μl离心管中，加入800μl的TE后混匀，在室温下以12 000转离心1min，重复5～6次，直至完全溶解;②再加入400μl TE，25μl 10% SDS，5μl 20mg/ml PK，37℃消化过夜;③吸上层清液，加入等体积的酚，摇荡15min，以12 000r/min离心10min，再次吸上层清液;④加入等体积的酚：氯仿（1：1），摇荡15min，以12 000r/min离心10min，吸上层清液;⑤再加入等体积的氯仿，摇荡15min，以12 000r/min离心10min，吸上层清液;⑥加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M乙酸钠，于-20℃下沉淀1h，以12 000r/min离心10min，弃上层清液，向沉淀中加入75%乙醇，以12 000r/min离心5min后弃上层清液，干燥后用100μl TE溶解，置于-20℃冷藏备用。
　　SNP位点rs4791774和rs1042522的基因分型采用TaqMan探针荧光定量PCR方法进行检测，所使用的仪器为罗氏LightCy-cler 480实时荧光定量PCR仪，基因分型试剂（Taq-Man Genotyping Master Mix）、TaqMan探针以及引物均购自美国ABI公司。PCR反应在罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行，反应体积为10μl，反应条件为95℃预变性10min，92℃变性15s、60℃退火1min，共40个循环，40℃延伸5min。以水代替模板DNA作为阴性对照。用罗氏LightCycler480荧光定量分析软件LCS480 1.5.1.62对实验数据进行基因分型，随机对SNPs位点的不同基因型样本进行测序，验证Taqman基因分型的结果。
　　1.4 统计学分析：采用SPSS 21.0软件对统计数据进行整理分析，计数资料采用百分比表示，计量资料采用均数±标准差（x?±s）表示，p53基因中SNP位点rs12947788和rs1042522等位基因及基因频率在两组人群中的分布差异采用χ2检验，采用Hardy-Weinberg平衡检验分析p53基因型在两组人群中的分布，采用Logistic回归模型计算基因型和基因组模型的OR值及95%置信区间（CI）。使用在线软件SHEsis计算两个SNPs位点在两组间的连锁不平衡，当连锁不平衡值r2和D′均>0.8时认为位点间存在强连锁，以P<0.05为差异存在统计学意义。
　　2  结果
　　2.1 研究对象的基本特征：试验组为非综合征性唇腭裂患儿100例，对照组同期正常无先天性畸形正常患儿100例。两组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.080、0.188，均P>0.05）。见表1。
　　2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡分析：Hardy-Weinberg平衡定律检验分析试验组与对照组，分析表明两个SNPs位点rs4791774和rs1042522在两组人群中均符合遗传平衡条件（P>0.05），提示本研究所选的样本是具有群体代表性的随机样本。
　　2.3 p53基因中多态性位点与NSCL/P的相关性分析：在两个p53基因多态性位点与非综合征性唇腭裂的相关性分析中，p53 rs12947788的等位基因变体A携带者（AA+GA vs GG）发生非综合征性唇腭裂的风险增加（OR=1.393，95%CI 1.030～1.884，P=0.032）。除此之外其他基因型均与非综合征性唇腭裂的发病风险无明显相关关系。见表2。
　　2.4 p53基因两个多态位点与NSCL/P发病风险相关性：根据危险因素将研究人群的母亲进行分层时，发现两个SNPs位点中，有2个与NSCL/P发病风险增加相关。rs1042522（CC vs CG+GG）增加吸烟者母亲生下NSCL/P患儿的风险（OR=2.561，95% CI=1.146～5.721，P=0.022）。rs12947788（AA+GAvsGG）可显著增加有饮酒史母亲（OR=3.235，95%CI=1.158～9.040，P=0.025）生下NSCL/P患儿的风险。见表3。
　　2.5 p53基因多态性位点的连锁不平衡分析：对p53基因的两个SNPs位点多态性进行连锁不平衡分析，结果显示不存在明显的连锁不平衡（r2<0.08，D′<0.08），见表4。 　　3  讨论
　　唇腭裂作为一种最常见的颌面部先天畸形之一，根据是否伴有其他先天性畸形可以分为综合征性唇腭裂（Syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非综合征性唇腭裂（Non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）[15-16]。有研究表明SCL/P是单基因遗传疾病，而NSCL/P的发病机制则较为复杂，且有较多研究证明NSCL/P的病因与多种因素有关。国外有一项研究表明[17-18]，NSCL/P不符合孟德尔遗传定律，证明NSCL/P的发生发展受遗传和环境两种因素共同影响。截止目前，国内外已发现有十几个基因与NSCL/P的发生发展有关。
　　人体抑癌基因p53是目前国内外被研究的最多的肿瘤抑制基因之一，定位于人染色体短臂17p13.1区，长度约为16～20Kb，构成包括11个外显子和10个内含子，主要用于人体编码由393个氨基酸组成的p53核内磷酸蛋白，25Kb的mRNA是其转录产物[19-20]。p53蛋白分为两种亚型，野生型p53（wtp53）是抑癌基因，主要用来校正DNA保持正常、介导细胞凋亡。突变型p53（mtp53）通常会刺激细胞，发挥癌基因的作用，抑制细胞凋亡。已有研究证明[21-22]，p53基因突变与包括呼吸系统、生殖系统等多个系统在内的原发性肿瘤密切相关。有动物模型研究发现，抑癌基因p53的缺失会导致小鼠胚胎发育畸形，具体表现为颅面畸形[23-24]。在本研究两个p53基因多态性位点与非综合征性唇腭裂的相关性分析结果中发现，rs12947788的等位基因变体A携带者（AA+GA vs GG）发生NSCL/P的风险增加（OR=1.393，95%CI 1.030～1.884，P=0.032）。除此之外其他基因型均与NSCL/P的发病风险无明显相关关系。在本研究p53基因两个多态位点与NSCL/P发病风险相关性的分析结果中，根据危险因素将研究人群的母亲进行分层时，发现两个SNPs位点中，有2个与NSCL/P发病风险增加相关。rs1042522（CC vs CG+GG）增加吸煙者母亲生下的小儿发生NSCL/P的风险（OR=2.561，95% CI=1.146～5.721，P=0.022）。rs12947788（AA+GAvsGG）可明显增加有饮酒史母亲（OR=3.235，95%CI=1.158～9.040，P=0.025）生下的小儿患NSCL/P的风险。
　　对于本研究有与国内外相关研究不一致或有相矛盾的地方，可能是由于NSCL/P的发生存在着明显的种族和地域差异[25-26]所致。且基因在不同地区和人群中亦有着较大的差异性，这可能导致NSCL/P的易感基因会随着人群的不同而不同。我国种族较多，地域辽阔，大量的研究表明对于复杂的与遗传和环境相关的疾病，需要将人群通过地域分开来进行研究[27]。且本研究样本量较少，与先前国内外相关研究结果不一致也可能是由样本量不足所导致的，扩大样本量及样本收集范围后得到的研究结果可能会更具有临床意义。
　　综上所述，p53基因rs12947788的等位基因变体A的携带者会增加NSCL/P的发生风险;p53基因rs12947788可明显增加有饮酒史母亲生下NSCL/P患儿的风险;p53基因rs1042522可明显增加有吸烟史母亲生下NSCL/P患儿的风险。
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　　[收稿日期]2019-09-11
　　本文引用格式：邵帥，张莉，刘华，等.云南汉族非综合征性唇腭裂与p53基因多态性的相关性研究[J].中国美容医学，2020，29（4）：108-112.
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