纯种米曲霉发酵制备阳江豆豉及其抗氧化活性研究

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　　摘 要：本文研究了纯种米曲霉发酵工艺制备阳江豆豉的各项参数;探讨前发酵期添加黑豆水解液、后发酵期添加不同盐量对豆豉抗氧化活性的影响。以强抗氧化活性物质维生素C为对照，采用二苯代苦味基肼自由基（DPPH）法、Fe3+还原法和羟基自由基法3种方法检测抗氧化活性。结果显示，黑豆发酵过程中，抗氧化活性逐渐增强，黑豆水解液诱导法纯种发酵制备豆豉的抗氧化活性比传统工艺纯种发酵豆豉的抗氧化活性强，低盐后酵的豆豉抗氧化活性效果较强。
　　关键词：豆豉;纯种米曲霉;发酵;诱导法;抗氧化活性
　　中图分类号：S-3       文献标识码：A
　　DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530006
　　豆豉是一种以大豆为原料的传统发酵食品，在我国有2000多年的制作和食用历史[1]。根据原料不同、制曲微生物不同、发酵时是否加食盐等标准，有不同的分类方法[2]。豆豉含有丰富的营养物质和生物活性物质，不仅能调味，还可以入药[3]。其中富含的抗氧化成分，可以清除体内自由基，提高机体抵抗癌症、冠心病和老年疾病的能力[4，5]。
　　在传统的生产方式和工艺条件下，不同豆豉产品有其特有的风味。也因传统自然发酵条件变化的限制，存在品质不稳定、生产周期长、风味难以控制等问题。选用经筛选各项性能指标优良的豉曲作为发酵菌种，采用适宜的工艺，可以缩短发酵周期，提高生产效率，并赋予产品稳定的风味[6]。
　　阳江豆豉作为广东传统特产广为人知，已有数百年的生产历史，畅销国内市场及东南亚、欧美和大洋洲30多个国家和地区[7]。本文以阳江本地黑豆作为原料，以在阳江豆豉生产企业曲房中分离纯化的米曲霉为曲种，研究阳江豆豉纯种发酵工艺的条件，发酵过程中抗氧化物质含量的变化[8];研究前发酵期添加黑豆水解提取液对调控豉曲的酶活性，后发酵期添加不同浓度食盐对发酵速度、发酵程度和抗氧化物质含量的影响[9，10]。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 实验原料
　　纯种米曲霉菌株（本实验室筛选）;本地黑豆、食盐（本地超市购买）。
　　1.1.2 实验试剂
　　葡萄糖、琼脂、蛋白胨、MgSO4·7H2O、二苯代苦味基肼自由基（DPPH）、无水乙醇、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、抗坏血酸、30%过氧化氢。上述试剂、药品均为分析纯，均购自广州化学试剂公司。PDA培养基，购自北京陆桥技术有限公司。
　　1.2 仪器和设备
　　酸度计（PHS-25型、上海虹益仪器仪表有限公司）、均质器（MJ-25BM01A型、广东美的精品电器制造有限公司）、可见分光光度计（722G型、上海仪电分析仪器有限公司）、电热恒温培养箱（DPH-9082型、上海一恒科学仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-4型、常州澳华仪器有限公司）、电子分析天平（ALC-210.4型、ACCULAB公司）、高速冷冻离心机（GT16-2型、广州市正一科技有限公司）、生物显微镜（CX21F51型、OLYMPUS公司）、立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LX-C35L型、合肥华泰区疗设备有限公司）、超净工作台（SW-CJ-1F型、苏州安泰开启技术有限公司）。
　　1.3 试验方法
　　检测食品中抗氧化物质含量的方法很多，常用的有二苯代苦味基肼（DPPH）自由基法、Fe3+还原法、羟基自由基法、ABTS法、硫代巴比妥酸（ABARS）法和氧自由基清除能力测定法（ORAC）等[11]，本文中采用前3种方法。
　　1.3.1 纯种米曲霉孢子悬浮液的制备
　　米曲霉是豆豉发酵过程中起主要作用的微生物，生长速度快且能分解蛋白质和脂类等多种物质，纯种米曲霉制作豆豉是通过接种培养的米曲霉孢子来发酵的。
　　采用本实验室分离保藏的米曲霉（实验室编号171020）作为发酵菌种，用于豆豉的制作。从保存的菌种斜面培养基中挑取少量纯种米曲霉孢子，接种于灭菌冷却后的新鲜PDA斜面培养基，28℃培养7d，至斜面培养基表面长出大量深绿至墨绿色的孢子;向培养成熟米曲霉的试管斜面中注入无菌水5mL，轻轻刮取米曲霉孢子洗入无菌水，再转入已经灭菌包含玻璃珠的50mL锥形瓶。重复上述操作3次，洗脱斜面的孢子。振荡锥形瓶打散孢子，使其均匀分布于水中。在显微镜下使用血球计数板对锥形瓶内的孢子悬浊液进行计数，可适量向锥形瓶中滴加无菌水，直至悬浮液中的孢子浓度为C=107个/mL[12];孢子悬浮液当天制备当天使用。
　　1.3.2 黑豆水解液的制备
　　有研究发现，米曲霉对黑豆中的蛋白质等大分子物质利用速度较慢。而黑豆粉中的蛋白质通过酸水解，部分小分子物质从黑豆中溶出，经离心可获得含有小分子物质的黑豆酸水解液。这些小分子物质可以直接被米曲霉利用，虽然含量很低，但其可作为中性蛋白酶合成的诱导剂，提升成曲的酶活力。酶活力的提高可以更充分地将黑豆中的蛋白质分解为多肽及氨基酸，为后酵微生物提供更充足营养成分，提高豆豉成品的质量[13]。黑豆水解液制备流程：黑豆→浸泡→磨浆→调节pH→水解→离心→上清液。
　　1.3.2.1 浸泡
　　称取已挑选的无虫蚀、无霉变的黑豆粒15g于50mL离心管，加入45mL蒸馏水，室温浸泡12h。
　　1.3.2.2 均质
　　用均质器进行均质，均质液用3层纱布过滤，收集滤液。
　　1.3.2.3 調节pH
　　向滤液中缓慢滴加0.1M盐酸，调节pH至5.5。
　　1.3.2.4 水解与离心
　　将调节pH后的滤液置于50℃水浴50min;5000r/min，4℃离心10min，小心移出上层清液到500mL锥形瓶。黑豆水解液不能长期保存，即制即用。 　　1.3.3 纯种米曲霉发酵豆豉制作工艺
　　参考阳江豆豉生产企业生产工艺，在实验室模仿其工艺条件并加以改进，主要步骤为：黑豆原料→筛选→浸泡→蒸煮→冷却→接种→制曲→洗曲→加盐水→后期发酵→成品。
　　1.3.3.1 筛选
　　挑选无虫蚀、无霉烂、新鲜完整饱满的黑豆粒5kg，用水冲洗3遍，去除黑豆表面的灰尘。
　　1.3.3.2 浸泡与蒸煮
　　加入3倍黑豆体积的自来水，在洁净的容器内浸泡16h，用洁净的盖子盖住容器，以避免污染;取浸泡过的黑豆，用筛子沥干水分，置于1L烧杯内，用3层纱布盖住杯口，在高压灭菌器内121℃处理20min。
　　1.3.3.3 接种及制曲
　　待蒸煮过的黑豆晾干后，豆粒表面水分快蒸发干时，在无菌操作台中，用事先准备好的菌种孢子悬浊液与豆粒搅拌混匀。搅拌时，注意不要太过用力，以不破坏黑豆表皮为宜。拌好的黑豆放入31℃的生化培养箱中培养制曲，每12h翻曲1次，制曲时间约为5d。
　　1.3.3.4 洗曲及发酵
　　用蒸馏水把豆粒表面的霉菌菌丝与孢子冲洗干净，去除霉味与苦涩味;洗好的曲分装到已灭菌的1L烧杯内，加入刚好能没过曲表面的盐水，用密封膜封闭容器口，放入36℃的培养箱中发酵25d左右。
　　1.3.3.5 成品
　　将发酵好的豆豉去掉汁液，从烧杯中倒入搪瓷托盘，在阳光下晾干豆豉表面水分，即为一般成品。或置于鼓风干燥箱中55℃干燥4h，使水分降至20%左右，即为干豆豉成品。
　　1.3.4 黑豆水解液诱导法纯种米曲霉发酵豆豉制作工艺
　　制作工艺与1.3.3相同，在冷却和接种步骤之间，增加“加入新鲜黑豆水解液”步骤。新鲜黑豆水解液的制作方法见1.3.2。
　　具体方法为：向冷却的黑豆中加入质量比为3%的新鲜黑豆上清液，轻轻搅拌混匀，尽量使装黑豆的容器底部没有明显的流动状液体。
　　1.3.5 豆豉制作的分组设计
　　黑豆水洗除杂后，筛选出完整饱满的黑豆，室温下用3倍体积的水浸泡16h，沥干黑豆表面的水。称量相同重量的黑豆分装于4个贴好样品编号标签的1L烧杯中，纱布封口后121℃灭菌20min。在洁净工作台冷却至室温，纯种米曲霉孢子悬浮液、新鲜的黑豆上清液的添加量如表1所示。1、2、3号为诱导法工艺制曲，4号为接种后传统发酵方法制曲。将所有的烧杯放入同一个培养箱中，31℃制曲5d。用煮沸后冷却的自来水分别洗去各烧杯中曲表面的菌丝，以不破坏表皮为宜，得到洗净的完整颗粒的黑豆曲。各烧杯中加入等量约为曲料体积1/2的盐水，1、2、3、4号烧杯的盐水浓度分别为9%、11%、13%、9%，搅拌均匀，用食品级保鲜膜密封烧杯口，在温度为38℃的恒温培养箱中发酵25d[14]。
　　
　　1.3.6 豆豉中抗氧化物质的提取
　　分别在第0、5、10、15、20、25d 6个时间点，称量10g上述1.3.5中4组发酵中的豆豉样品，用研钵快速研磨粉碎，以50%的乙醇反复冲洗研钵，收集研磨物及冲洗液于250mL锥形瓶中，加50%的乙醇溶液至总体积约为90mL。45℃水浴震荡1h，充分溶出豆豉中的抗氧化活性物质。转入容量瓶定容至100mL，全部转入离心管，8000r/min离心5min，小心吸取上层液体转移入新的离心管，作为豆豉中抗氧化物质待测样本[15]。
　　1.3.7 对[DPPH·]自由基清除能力的测定
　　抗氧化活性一个重要的机理就是清除自由基。DPPH带有一个氢自由基，能夠在517nm波长下有最大吸收值。当遇到氢自由基清除剂时，DPPH溶液的紫色迅速褪去变黄，吸收度变小，变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，清除率（﹪）=[A。-（A1-A2）]/A。×100%[16，17]。
　　吸取3mL样品溶液于10mL离心管中，加入0.16mmol/L的DPPH溶液3mL，于25℃水浴中放置15min后，于517nm波长下测得试样吸光度（A1）;取50%的乙醇测得空白吸光度（A0）;以3mL 50%乙醇替代3mL 0.16mmol/L的DPPH溶液测得样品本底吸光度（A2）。每个样品做3个平行测试。以0.05mg/mL的维生素C作为阳性对照。
　　1.3.8 对[·OH]自由基清除能力的测定
　　采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基，在该体系中加入水杨酸捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收值。当遇到自由基清除剂时，羟基自由基被清除，有色物质减少，吸收度变小，变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，清除率（﹪）=[A。-（A1-A2）]/A。×100%[18，19]。
　　吸取2mL样品溶液于10mL离心管中，加入2mL 50%乙醇，再分别加入0.5mL 9mmol/L FeSO4溶液、9mmol/L水杨酸和8.8mmol/L H2O2溶液，混匀，37℃水浴中加热30min，于510nm处测定样品吸光度（A1）;将体系中的样品溶液改为50%的乙醇，测得空白对照吸光度（A0），以0.5mL蒸馏水代替8.8mmol/L H2O2，测得样品本底吸光度（A2），每个样品做3个平行实验，计算清除率。以0.05mg/mL的维生素C作为阳性对照。
　　1.3.9 Fe3+还原能力的测定
　　根据反应：K3Fe（CN）6+样品→K4Fe（CN）6+样品氧化物;K4Fe（CN）6+Fe+3→Fe4[Fe（CN）6]3。
　　在700nm下Fe4[Fe（CN）6]3类物质有最大吸收值，所以当测得吸光度越大，则样品的还原能力越大[20]。
　　吸取2mL样品溶液于10mL离心管中，分别加入2mL 0.2mol/L磷酸盐溶液（pH6.6）和2mL 1%的铁氰化钾溶液，50℃保温20min，再加入2mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀后3000r/min离心10min，取上清液2mL，加入2mL蒸馏水以及0.4mL 0.1%三氯化铁溶液，室温反应10min，测定700nm处的吸光值，每个样品做3个平行实验。以0.05mg/mL的维生素C作为阳性对照。 　　2 结果与分析
　　2.1 纯种米曲霉（实验室编号171020）的分离鉴定和菌悬液制备  本实验室从阳江市豆豉生产企业的豆醅房指数生长期的产品采样分离取得实验室编号为171020的菌株，经形态学、生物化学和分子生物学鉴定为米曲霉（另行发表）。挑取单孢子接种于PDA斜面扩增。
　　
　　由图4可知，在后发酵过程中，随着时间的延长，无论传统工艺，还是诱导法制备的豆豉，对于DPPH自由基的清除能力都有升高的趋势;在相同发酵时间内，诱导法制备豆豉工艺发酵含盐量低的豆豉比含盐量高的豆豉清除DPPH自由基能力更强;后发酵期间，在相同发酵时间内，相同盐含量的豆豉，诱导法制备的豆豉比传统工艺制备的豆豉具有更高的清除DPPH自由基能力。通过25d的后发酵，诱导法制备的豆豉清除DPPH能力基本就会趋于稳定，且清除DPPH的能力最高可提升73.6%。
　　2.5 对羟基自由基的清除作用
　　由图5可知，在后发酵过程中，随着时间的延长，诱导法制备豆豉工艺发酵的豆豉和传统工艺发酵的豆豉，对于羟基自由基的清除能力都有升高的趋势;在相同发酵时间内，诱导法工艺发酵含盐量低的豆豉比含盐量高的豆豉清除羟基自由基能力更强;后发酵期相同盐含量的豆豉在相同发酵时间内，诱导法工艺制备的豆豉比传统工艺发酵的豆豉具有更高的清除羟基自由基能力。通过25d的后发酵，诱导法制备的豆豉清除羟基自由基能力基本就会趋于稳定，且清除羟基自由基的能力最高可提升1倍以上。
　　2.6 Fe3+还原能力的对比
　　
　　由图6可知，在后发酵过程中，随着时间的延长，诱导法和传统工艺制备的豆豉，抗氧化的能力都有升高的趋势;在相同发酵时间内，诱导法工艺含盐量低的豆豉比含盐量高的抗氧化活性更强;在相同发酵时间内，后发酵期相同盐含量的豆豉，诱导法制备工艺比传统工艺发酵的豆豉具有更高的Fe3+还原能力，即具有更强的抗氧化活性。通过25d的后发酵，诱导法制备的豆豉Fe3+还原能力基本就会趋于稳定。
　　3 结论与讨论
　　3.1 结论
　　纯种米曲霉制曲的豆豉在后发酵过程中，豆豉中抗氧化物质含量随着发酵时间的延长而提高，抗氧化能力大幅度增强，后期发酵的过程是生成高含量抗氧化物质的重要阶段。
　　诱导法纯种米曲霉制曲豆豉的后发酵过程中，添加盐的浓度对抗氧化活性有影响，后发酵相同时间的豆豉，抗氧化能力随着盐的浓度增大而下降。
　　为了更全面地了解关于豆豉抗氧化性的相关知识，后期发酵中加入不同浓度氯化钠溶液，进行了豆豉抗氧化性影响的研究，已知低盐浓度更有利于微生物的生长，但同时也增加了产品受到污染的可能性。高盐浓度不仅不利于微生物的发酵作用，而且发酵得到的食品不利于人体健康。
　　纯种米曲霉制备豆豉的后发酵期，诱导法制备豆豉工艺发酵得到的豆豉抗氧化能力增长速度快，能力提升大，传统工艺发酵的豆豉抗氧化能力增长慢，能力提升小。
　　本文以阳江豆豉为对象，研究了在豆豉发酵前期添加适量黑豆水解液研究诱导法制备纯种发酵豆豉的制备条件及抗氧化活性，以期缩短发酵周期，突破季节性限制。
　　3.2 讨论
　　本文中探索了关于纯种米曲霉制曲豆豉的抗氧化活性，对于豆豉的研究仅仅是冰山一角。未来还可以开展很多关于豆豉的其它方面的研究，如传统工艺制曲发酵豆豉的抗氧化活性研究、混合菌种制曲发酵豆豉的抗氧化活性研究、豆豉的微量元素研究、黑豆酸水解液中含有的小分子物质种类和组成、诱导蛋白酶作用的机理等。相信在未来，会出现更多关于豆豉的研究结果，以帮助人们从豆豉这类常见的食品或药材中获得健康饮食。
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　　（责任编辑 常阳阳）
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