超高效液相色谱法测定忍冬叶中5种黄酮成分

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　　 摘要：通过超高效液相色谱-二极管阵列检测法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，简称UPLC-DAD）测定忍冬叶中芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素5种黄酮类成分的含量。使用Agilent Elipse plus C18反向色谱柱（4.6 mm 100 mm，3.5 m），用乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）进行梯度洗脱（0～20 min，14%A;20～50 min，14%～17%A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90%A），流速为0.5 mL/min，进样体积为4 L，柱温为30 ℃，检测波长为350 nm。结果表明，芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素分别在0.28～27.68、0.43～43.28、0.80～53.27、0.27～27.48、0.16～16.46 μg/mL时与其峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为97.39%、99.03%、99.19%、98.88%、97.03%，相对标准偏差（RSD）分别为0.96%、0.27%、0.88%、0.64%、1.39%，说明仪器的精密度及方法的重复性均良好，符合定量测定的要求。综合研究结果得出，该方法操作简单、分离效果好、灵敏度高，可为忍冬叶的开发利用和质量控制提供方法学基础。
　　 关键词：：忍冬叶;黄酮;超高效液相-二极管阵列检测法;质量控制
　　 中图分类号：R284 文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2020）07-0226-04
　　 药用植物忍冬有花（金银花）、藤（忍冬藤）两大药用部位，其中金银花具有清热解毒、疏散风热的功效，忍冬藤具有清热解毒、疏风通络的功效。研究发现，作为非药用部位的忍冬叶，同样具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性[1-2]。研究还发现，忍冬叶中含有有机酸、黄酮和环烯醚萜苷等多类活性成分[3-4]，并且其绿原酸含量接近金银花，有时甚至高于金银花[5];忍冬叶中的黄酮含量则明显高于金银花和忍冬藤[6-8]。结合忍冬叶高产量、低价格的特点[9]来开发利用忍冬叶具有巨大的经济意义和社会效益。
　　 2015年版《中华人民共和国药典》中规定，绿原酸和木犀草苷为金银花的含量控制指标[10]，可以参照此标准对忍冬叶进行质量控制，但是由于指标成分略显单一，难以全面衡量忍冬叶的质量。关于忍冬叶成分含量检测的报道较多[11-13]，并且目前的研究已经具有同时测定多种活性成分的优势。本试验首次建立了用超高效液相色谱-二极管阵列检测法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，简称UPLC-DAD）同时测定忍冬叶中芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷及木犀草素5种黄酮类活性成分的检测方法，以期为忍冬叶的开发利用和多指标质量控制提供参考依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验仪器、试剂与材料
　　1.1.1 仪器 Agilent超高效液相色谱仪（型号6400，配备自动进样器、四元梯度泵和二极管阵列检测器）;分析天平（型号为AUW220D），购自SHIMADZU公司。
　　1.1.2 药品与试剂 对照品芸香苷（纯度为91.9%，批号为100080-201409），购自中国食品药品检定研究院;木犀草苷（纯度≥98%，批号为MUST-13060908），购自成都曼斯特生物科技有限公司;野漆树苷（纯度≥98%，批号为wkq916021802）、木犀草素（纯度≥98%，批号为wkq916051201）和忍冬苷（纯度≥98%，批号为wkq18072701），均购自四川省维克奇生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱级试剂，购自Thermo Fisher公司。
　　1.1.3 试验样品 6批忍冬叶采自河南省的不同地区，经河南中医药大学陈随清教授鉴定，这些样品均为忍冬科忍冬属忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥叶片，标本存放于河南省科学院天然产物重点实验室，标本编号依次为150503、170504、170505、170506、170507、170708。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 样品的制备
　　1.2.1.1 对照品溶液的制备 分别精确称取适量芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素對照品，并分别置于5个25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别制成质量浓度为276.80、226.38、532.68、274.79、164.64 μg/mL的对照品储备液。于4 ℃储存、备用。
　　1.2.1.2 供试品溶液的制备 精确称取约0.15 g忍冬叶粉末，过三号筛，置于25 mL棕色量瓶中，加约24 mL色谱级甲醇，超声处理1 h，自然冷却后用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
　　1.2.2 色谱条件 色谱柱为Agilent Elipse Plus C18柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，14% A;20～50 min，14%～17% A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90% A），流速为0.5 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为350 nm，进样体积为4 μL。
　　1.2.3 方法学考察
　　1.2.3.1 线性关系、检出限及定量限[14]的考察 精确吸取各2.5 mL芸香苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素对照品溶液及5 mL木犀草苷对照品溶液，置于25 mL棕色量瓶中，用含量≥99.5%的甲醇溶液溶解，定容，制成芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素质量浓度分别为27.68、45.28、53.27、27.48、16.46 μg/mL的混合对照品溶液。分别吸取2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.1、0.05、0.02 mL混合对照品溶液置于2 mL棕色量瓶中，用甲醇定容。按照“1.2.2”节的色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归分析，并计算各对照品的检出限[信噪比（S/N）=3 ∶1]和定量限（S/N=10 ∶1）。 　　1.2.3.2 精密度试验 取适量稀释后的混合对照品溶液，按照“1.2.2”节的色谱条件进行检测，连续进样6次，记录各峰面积。
　　1.2.3.3 重复性试验 取任一忍冬叶样品6份，按照“1.2.1.2”节的方法制备6份供试品溶液，按照“1.2.2”节的色谱条件进行检测，记录各峰面积。
　　1.2.3.4 稳定性试验 取任一忍冬叶的同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48、72 h进样，记录各峰面积。
　　1.2.3.5 加样回收率试验 精确称取9份已知黄酮含量的忍冬叶样品，随机分为3组，分别加入高、中、低3个浓度的芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素对照品溶液，先按照“1.2.1.2”节的方法制备9份供试品溶液，再按照“1.2.2”节的色谱条件进行检测，计录各峰面积，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。
　　1.2.4 样品测定与数据分析 取不同产地或批次的忍冬叶，按照“1.2.1.2”节的方法分别平行制备3份供试品溶液，按照“1.2.2”节的色谱条件进行检测。根据不同样品检测结果中各个化合物的峰面积，用线性方程计算出所检测溶液中各个化合物的浓度，再结合检测过程中稀释倍数等其他因素，最终求得待测样品中各个化合物的含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 标准曲线的绘制
　　 依据“1.2.3.1”节的不同对照品溶液浓度对检测结果进行线性回归，得到5种待测黄酮化合物的回归方程，并计算其检出限与定量限，结果见表1。
　　2.2 方法学考察结果
　　2.2.1 精密度试验 通过计算得出，标准品溶液中芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素峰面积的RSD（n=6）分别为1.12%、0.70%、0.78%、0.76%、0.73%，表明仪器的精密度良好，符合定量测定要求。
　　2.2.2 重复性试验 取6份忍冬叶170708样品，制成供试品溶液后进行检测，计算得出芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素含量分别为406.7、1 475.0、7 060.4、577.6、174.0 μg/g，RSD（n=6）分别为2.89%、1.88%、2.87%、1.15%、2.33%。说明该方法的重复性良好，符合定量测定的要求。
　　2.2.3 稳定性试验 取忍冬叶170708的同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48、72 h进样，计算得出， 芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素含量的RSD（n=7）分别为0.98%、1.24%、0.69%、1.20%、0.33%，表明所测5种黄酮成分在72 h内的稳定性良好。
　　2.2.4 加样回收率试验 精确称取9份已知含量的忍冬叶样品（忍冬叶170708），随机分为3组后，在每组中分别加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液，制成9份供试品溶液后进行检测。由表2可以看出，该检测方法的准确度较高。
　　2.3 样品测定结果
　　 6份不同产地或批次的忍冬叶的液相色谱结果见图1，计算结果见表3。可以看出，忍冬叶中这5种黄酮含量差别较大，其中芸香苷和木犀草素的含量较低，木犀草苷、忍冬苷和野漆树苷的含量较高，而且不同产地的每种黄酮成分的含量差异也较大。
　　3 讨论与结论
　　 在对流动相体系进行筛选的过程中[15-16]，笔者先后考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液4种体系，结果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液体系下的色谱峰分离度较好，基线也较稳定。采用二极管阵列检测器对5个黄酮成分在波长为190～400 nm的范围内进行扫描，发现芸香苷分别在256、353 nm处有最大、较大吸收，而木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷、木犀草素依次在347、350、340、350 nm处有最大吸收。分析比较得出，在350 nm波长下得到的色谱峰较好且检测结果稳定，因此统一选择350 nm作为检测波长。对提取溶剂（甲醇、50%甲醇、70%乙醇）的考察结果表明，用甲醇超声提取1 h后，待测化合物的色譜峰响应值相对较大。
　　 对忍冬叶中5种黄酮类成分（芸香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆树苷和木犀草素）含量的测定结果显示，不同产地或批次的忍冬叶中5种黄酮类成分含量不一。总体来说，木犀草苷和忍冬苷的含量相对较高，芸香苷和木犀草素的含量相对较低。本检测方法操作简单，分离效果好，灵敏度高，重现性好，可以为忍冬叶的进一步开发利用及质量控制提供试验依据。
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