高效液相色谱法测定保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量

来源:用户上传      作者:

　　[摘要]目的 采用高效液相色谱法测定保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量，为进一步提高其质量控制提供依据。方法 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus Cl8（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，检测波长为250nm。结果 葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系（r>0.9990）;平均加样回收率（n=6）分别为101.47%。结论 建立了五味子猴菇口服液中葛根素的含量测定的方法，方法重复性良好，为该保健食品的产品质量控制提供依据。
　　[关键词]高效液相色谱法;五味子猴菇口服液;葛根素;含量测定
　　[中图分类号]R917
　　[文献标识码]A
　　[文章编号]2095-0616（2020）01-39-04
　　五味子猴菇口服液以吉林省道地中药材五味子、东北特产猴头菇为主要原料，以及对肝损伤有保护作用的银耳、葛根、甘草、枳棋子等原料开发的一种对酒精性肝损伤具有辅助保护作用的保健食品。五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲等均有降低因化学物质引起的血清转氨酶升高、诱导肝脏药物代谢酶的作用。五味子对BCG+LPS诱发的肝损伤有显著的防治作用，从免疫机制的角度证明了五味子的保肝降酶作用[1-4]。猴头菇其药效成分主要有多糖、低聚糖、猴头菇素和猴头菇酮等，具有保肝养胃、增强免疫力、降血糖、保护神经、抗癌和抗氧化等功效。现代研究发现，猴头菇中多糖成分在胃黏膜保护方面作用尤为突出[5-7];银耳多糖口服或腹腔注射能对抗谷丙转氨酶活性的升高，缓解肝细胞损伤[8-9];葛根提取物（主要成分为葛根总黄酮和葛根素）能提高小鼠对酒精的耐受阈值和醉酒潜伏期，加速酒精代谢、降低其肝毒性[10-11];甘草浸膏口服，对四氯化碳所致大鼠肝损伤有明显保护作用[12-13];枳棋子有显著的解酒、保肝、抗肝纤维化等作用，水提取液可显著缩短小鼠酒醒时间、加快乙醇代谢，对乙醇所致肝损伤的预防作用等[14-16]。我国保健食品市场对于酒精肝损伤的护肝保肝产品需求量很大，尽管市场该类产品的研发很多，但大多数产品的功效不显著。本研究采用HPLC对保健食品五味子猴菇口服液中葛根素的含量进行测定，为进一步提高产品质量控制提供有利依据。
　　1 资料与方法
　　1.1一般资料
　　高效液相色谱仪（1260型，美国安捷伦）;超声波清洗器（KQ-500型，昆山市超声仪器有限公司）;电子天平（BSA224S-CW型，赛多利斯电子天平），电子天平（QUINTIX125D-1CN型，赛多利斯电子天平）。
　　纯净水（娃哈哈），乙腈（色谱纯），其他试剂均为分析纯。葛根素对照品（含量均大于95.4%，110752-201615，中国食品药品检定研究院）。五味子猴菇口服液（规格为：25mL/瓶;批号分别为：20181201， 20181202， 20181203，自制）。
　　1.2方法
　　1.2.1色谱条件 1260型Agilent高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）;进样量：10μL;柱温：25℃;检测波长：250nm;流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（12：88）;流速：1.0mL/min。
　　1.2.2溶液的制备[17]
　　1.2.2.1供试品溶液的制备 吸取五味子猴菇口服液5mL，置25mL容量瓶中，精密称定，加70%甲醇至刻度，超声处理（功率250W，频率40kHz）5min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
　　1.2.2.2对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品8.89mg（纯度为95.4%），于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密吸取l.OmL于25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成质量浓度为16.96212μg/mL的对照品溶液。
　　2 结果
　　2.1线性关系
　　精密吸取“1.2.2.2”对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别至25mL容量瓶中，加甲醇的定容至刻度，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，以各对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，计算得线性方程为Y=45.167X+4.2168，r=0.9999，结果表明葛根素浓度在8.48106～42.4053μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。见表1、图1。
　　2.2稳定性试验
　　取批号为20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48h按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，结果葛根素含量的RSD分别为0.4%。
　　2.3精密度试验
　　取同一供试品（20181201），按“1.2.1”项下色谱条件下连续进样6次，结果葛根素含量的RSD分别为0.3%。
　　2.4重复性试验
　　取批号为20181201的五味子猴菇口服液，照“1.2.2.1”方法制备6份供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，结果葛根素含量的RSD分别为1.4%。
　　2.5加样回收率试验
　　取已知含量的同一批五味子猴菇口服液（20181201）6份各5mL，精密称定，分别加入葛根素对照品1mL（浓度为0.424053mg/mL）按“1.2.2.1”制备供试品溶液，按“1.2.1”条件进行测定，进行加样回收率考察，平均回收率为101.47%，RSD為1.10%（n=6），表明本方法测定葛根素准确率较高，回收率结果见表2。
　　2.6样品含量测定
　　按“1.2.2.1”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项条件进行测定，计算葛根素的含量，见表3。 　　3 讨论
　　3.1流动相和样品前处理的考察
　　本试验参照“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的测定”，对流动性洗脱系统、样品前处理进行了考察[10]。
　　3.1.1流动相选择 考察了乙腈一磷酸溶液及甲醇一磷酸溶液流动相系统，乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相的洗脱系统，色谱峰形好，分离度较好，因此选择乙腈-0.05%磷酸溶作为流动相系统。
　　3.1.2试样处理 对“GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的测定”中试样处理的两种方法进行了比较，结果试样加适量70%甲醇，超声提取，定容后分析的方法優于试样上D101大孔吸附树脂层析柱，再用70%甲醇洗脱，蒸干定容的方法，原因在于五味子猴菇口服液为口服液，上D101大孔吸附树脂层析柱进行柱层析方法繁琐，回收率较低、重复性较差，故选择前者为试样处理方法。
　　3.2色谱柱考察
　　对不同厂家色谱柱进行了考察，选用了Diamonsil（钻石）C18（4.6mm×250mm，5μm）、Shimadzu C18（4.6mm×250mm，5μm）、AgilentZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）三种不同色谱柱，结果Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6mm×250mm，5μm）对葛根素的分离效果最好。
　　西医目前主要从戒酒、营养支持和药物治疗两个方面治疗酒精性肝损伤，但作用较局限;以中药原料在对化学性肝损伤又辅助保护功能的保健食品中应用较为普遍，剂型的选择以服用方便、便于携带为主[18-20]。五味子猴菇口服液以五味子、猴头菇、银耳、葛根、甘草、枳棋子等原料，经过制备工艺和质量标准、结合药理活性筛选的最佳处方，以保证其安全、有效、合理，为开发保健食品提供理论依据。
　　本研究建立了高效液相色谱法测定五味子猴菇口服液中葛根素的含量方法，通过方法学的考察确定以250nm为检测波长，70%甲醇为提取液，超声提取5min，葛根素在8.48106～42.4053μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系（r>0.9990），平均加样回收率（n=6）分别为101.47%，结果准确，方法可操作性强。
　　[参考文献]
　　[1]艾阳文，李维亮，辛华雯.中药五味子治疗药物性肝损伤的研究进展[J].中国药师，2018，21（3）：477-480.
　　[2]许月本.五味子的药理作用和临床应用研究进展[J].中医药导报，2015，21（17）：104-106.
　　[3]陈丰.枳葛解酒保肝方对大鼠酒精性肝损伤的防治作用及机制探讨[D].北京：北京中医药大学，2018：95.
　　[4]周园，王涛，周玖瑶.五味子防治小鼠急性酒精中毒作用的实验研究[J].时珍国医国药，2011，22（2）：505-506.
　　[5]刘国强，郭梁，徐伟良，等.猴头菇活性成分的研究进展[J].陕西农业科学，2018，64（9）：89-92.
　　[6]董蓬，刘忠华，国冬梅，等.猴头菇山楂功能性饮料对胃黏膜损伤的辅助保护功能研究[J].山东化工，2019，48（6）：123-124.
　　[7]李启艳，王慧.不同山楂制剂对大鼠胃黏膜的保护作用研究[J].山东化工，2019，48（6）：21-22.
　　[8]徐灿，刁嘉茵，王淑美.银耳多糖的药理研究进展[J].今日药学，2018，28（3）：207-210.
　　[9]薛莉.银耳提取物对酒精性肝损伤辅助保护作用[J].菌物学报，2014，33（5）：1112-1118.
　　[10]李昕，潘俊娴，陈士国，等.葛根化学成分及药理作用研究进展[J].中国食品学报，2017，17（9）：189-195.
　　[11]张瑞婷，周涛，宋潇潇，等.葛根的活性成分及其药理作用研究进展[J].安徽农学通报，2018，24（1）：15-17.
　　[12]林辉东，胡晓明，卢志平.还原型谷胱甘肽联合复方甘草酸苷治疗酒精性肝硬化的临床疗效观察[J].中国医药科学，2013，3（10）：85-86，113.
　　[13]朱世超，郑学敏，张玥，等.甘草次酸衍生物抗肝纤维化的实验研究[J].中草药，2017，48（17）：3554-3559.
　　[14]王文香，田菊霞，关媛媛，等.枳棋子对大鼠酒精性肝损害的影响[J].浙江中医杂志，2012，47（5）：370-371.
　　[15]郭起岳，吴贤生，余庆涛，等.葛根枳椇子栀子胶囊对大鼠急性肝损伤的保护作用[J].湖南中医杂志，2016，32（9）：162-165.
　　[16]钟宇萧，郑晓晗，覃兰妹，等.枳棋子水提取液对急性酒精中毒家兔离体小肠运动的影响及其解酒机制探讨[J].中国民族民间医药，2018，27（21）：19-22.
　　[17]中华人民共和国卫生部.GB/T 22251-2008.保健食品中葛根素的测定[s].北京：中国标准出版社，2008.
　　[18]王明春，吴承荣，姜英，等.酒精性肝病的研究进展[J].吉林大学学报（医学版），2009，28（11）：733-735.
　　[19]谈启军，刘近明，赵国荣，等.中医药防治酒精性肝病的实验研究进展[J].湖南中医杂志，2019，35（3）：151-154.
　　[20]丁春予.降低酒精性肝损伤保健食品五灵片的研究[D].长春：吉林大学，2018：55.
　　（收稿日期：2019-05-31）
　　[基金项目]吉林省中医药科技项目（2019155）;吉林省科技发展计划项目（20180623037TC）。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15120153.htm