高效液相色谱法测定漆姑草中芦丁和槲皮素含量

来源:用户上传      作者: 高智席 吴艳红(等)

　　摘要：建立了漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）中芦丁和槲皮素含量的反相高效液相色谱―二极管阵列检测法，采用乙醇―超声波提取， 以Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）为色谱柱， 以甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）为流动相， 流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ， 柱温为３０ ℃， 检测波长为２５５ ｎｍ。芦丁和槲皮素能得到较好的分离， 分别在０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）和０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４）的浓度范围内与峰面积成良好线性关系， 检测限分别为１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。本方法操作简单、准确度高、重现性好， 可用于漆姑草药材的质量控制，为漆姑草质量标准的制定提供依据。
　　关键词：漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；芦丁；槲皮素；高效液相色谱法
　　中图分类号：Ｏ６５７．７＋２ 文献标识码： Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）07－1444-03
　　
　　Contents ｏｆ Ｒｕｔｉｎ ａｎｄ Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ） Ｏｈｗｉ Determined ｂｙ ＨＰＬＣ
　　
　　ＧＡＯ Ｚｈｉ－ｘｉ１，ＷＵ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＬＩ Ｇａｎｇ２，ＭＵ Ｑｉｎｇ－ｓｏｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎ１，ＡＯ Ｋｅ－ｈｏｕ１
　　（１． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Gｕｉｚｈｏｕ Nｏｒｔｈ’ｓ Cｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Rｅｓｏｕｒｃｅｓ Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ / Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ＨＰＬＣ－ＰＤＡ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Sｗｅｅｔ） Oｈｗｉ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｆｒｏｍ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗａｖｅ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ Ｃ１８ （Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ ２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ） ｃｏｌｕｍｎ， ｗｉｔｈ ＭｅＯＨ ａｎｄ Ｈ２Ｏ（６０∶４０， Ｖ／Ｖ） which contained 0.2% phosphoric acid ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２５５ ｎｍ． Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ method ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）ａｎｄ ０．０４~２０．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４） ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｗｅｒｅ １２．６ ａｎｄ １５．２ ｎｇ／ｍＬ ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ waｓ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｒｅｌｉａｂｌｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ａｎｄ could ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ it ｏｆｆｅｒed ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ｓｗｅｅｔ） ｏｈｗｉ； ｒｕｔｉｎ； ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ； ＲＰ－ＨＰＬＣ
　　
　　漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ），又名牛毛粘、蛇牙草、大龙叶、虾子草、大龙草等，为石竹科植物漆姑草的全草。分布于江苏、四川、湖南、湖北、贵州、云南等地。该药常用于治疗漆疮、秃疮、湿疹、丹毒、瘰疬、无名肿毒、毒蛇咬伤、龋齿痛、跌打内伤等［１］。漆姑草味苦，性凉，有散结消肿，解毒止痒之功效［２］。研究表明，漆姑草中含有黄酮类成分［３］。分析漆姑草中的芦丁和槲皮素含量对漆姑草的药物开发应用具有重要意义。
　　黄酮类物质对人体健康有重要作用，因其在抗氧化、清除自由基以及对过敏、感染、高血压、肿瘤等疾病治疗方面的积极作用，受到研究者的重视［４］。黄酮的分析方法有分光光度法［５－７］、荧光法［８，９］、电化学分析法［１０，１１］等，目前分析测定芦丁和槲皮素使用最广泛的是高效液相色谱法［１２－１５］。但用反相高效液相色谱―二极管阵列检测法（ＲＰ－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）测定漆姑草中黄酮类化合物尚未见报道。本研究对漆姑草中芦丁和槲皮素进行了分离与测定，方法简便可行、重现性好。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 仪器和试剂
　　Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０１０ＡＴ型高效液相色谱仪，ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二极管阵列检测器（日本岛津公司）；ＳＹ３２００超声波清洗器（上海声源超声波仪器设备有限公司）；ＲＥ－５２９９旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；ＤＨＧ－９０７０Ａ型新型电热恒温鼓风干燥箱（宁波江南仪器厂）；自制索式提取器；植物粉碎机（２０～１２０目）；８００型离心沉淀器（上海手术器械厂）；微孔过滤装置。
　　芦丁和槲皮素标准品（９８％）均购自国药集团化学试剂有限公司，芦丁标准品批号：Ｆ２００９０７０２；槲皮素标准品批号：Ｆ２００９０２２５；乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（分析纯，遵义师范学院试剂厂），盐酸（ＡＲ）、Ｈ２ＳＯ４（ＡＲ）、石灰水（自制）、脱脂棉、无水乙醇（徐州试剂二厂），石油醚（上海试剂一厂）。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔径的滤膜过滤。
　　收集了不同产地漆姑草药材。经遵义医学院黎刚老师鉴定为石竹科植物漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ）的全草。
　　１．２ 色谱条件
　　色谱柱：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）。流动相为甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝ ６０∶４０（Ｖ／Ｖ），用前经０．４５ μｍ 滤膜过滤，流速 ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温３０ ℃；检测波长２５５ ｎｍ；进样量２０ μＬ。
　　１．３ 标准溶液的配制
　　准确称取０．０１０ ０ ｇ芦丁和槲皮素， 用甲醇（分析纯）溶解，超声振荡１５ ｍｉｎ，放置至室温用甲醇并定容至５０ ｍＬ，摇匀备用。吸取已配制好的标准溶液来配制一系列不同浓度溶液分别进样。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔径的滤膜过滤。

　　１．４ 样品前处理
　　将购买的漆姑草分别用粉碎机粉碎，４０目过筛后，放在烘箱中于６５ ℃烘１０ ｈ。准确称取４０ ｇ漆姑草粉末置于索氏浸提管中，高度不超过虹吸管，以石油醚为脱脂剂于４５ ℃水浴锅中脱脂２０ ｈ。充分除去样品中脂类和脂溶性色素后，将滤纸包取出，先用电吹风吹干。再置于干燥箱６５ ℃烘２ ｈ后。置于１００ ｍＬ三角烧瓶中，待下一步制备［１６］。
　　１．５ 样品溶液的制备
　　称取脱脂的漆姑草粉末１０．００ ｇ，置入超声破碎仪，加入２００ ｍＬ ７０％乙醇，超声破碎处理３０ ｍｉｎ，超声频率为２０ ｋＨｚ，每工作７ ｓ暂停３ ｓ，温度设置为２５ ℃。抽滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，得粗提物［１６］。
　　准确称取样品适量，甲醇溶解完全后转入５０ ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到供试品溶液。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 检测波长的选择
　　通过ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二极管阵列检测器对芦丁和槲皮素的标准溶液进行在线扫描，得到化合物芦丁和槲皮素的紫外吸收光谱。结果表明槲皮素在２５５ ｎｍ 和３７２ ｎｍ 处均有较强吸收，芦丁在２５６ ｎｍ 和３５５ ｎｍ 处有较强吸收。通过试验在２５５ ｎｍ 处各物质能取得较强吸收， 故选择测定波长为２５５ ｎｍ。在该波长下进行测定，既保证了较高的分析灵敏度，又无干扰。
　　２．２ 流动相的选择
　　黄酮类物质都微溶于水，而溶于有机溶剂，分别以乙腈／离子对溶液、乙腈／水、甲醇／离子对溶液和甲醇／水体系作流动相，对芦丁和槲皮素及其杂质的分离效果进行考察，当选用甲醇－水溶液作溶剂时分离效果最佳。当甲醇∶水＞７０∶３０（Ｖ／Ｖ）时，分离效果不好；当甲醇∶水＜５０∶５０（Ｖ／Ｖ）时，分析时间明显增长，峰形扩展严重。而在甲醇∶水＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）时，能取得较好的分离效果，但是色谱峰稍有拖尾现象，通过加入０．２％的磷酸溶液能消除峰拖尾， 本试验选择甲醇∶水（０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）作为流动相。
　　２．３ 流速的选择
　　随流速增加，各峰的保留时间均减少，流速在０．３～０．８ ｍＬ／ｍｉｎ均能很好分离，但流速在０．５ ｍＬ／ｍｉｎ以下时，色谱峰逐渐扩展，检测灵敏度下降。流速在０．８ ｍＬ／ｍｉｎ以上时，芦丁峰与相邻峰重叠，分离度下降。在一定波长、流动相的条件下，分别测定了不同流速时的标准芦丁和槲皮素，发现以流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ时，芦丁和槲皮素与杂质分离完全、峰形对称。本试验选择实验进样流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ。
　　２．４ 线性范围及检出限
　　在上述色谱条件下，测定不同浓度的芦丁和槲皮素标准品，以溶液浓度（ｘ）与峰面积（ｙ）作标准曲线。芦丁和槲皮素分别在０．０３～１５．００ μｇ／ ｍＬ、０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ范围内，浓度（ｘ）与峰面积（ｙ）有很好的相关性，回归方程为ｙ＝６．９１５×１０４ｘ＋２．０６３×１０３、ｙ＝ ８．９８９×１０４ｘ＋１１５．２００，相关系数分别为０．９９９ ０和０．９９９ ４，能够满足定量分析的要求。检出限分别为１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。芦丁和槲皮素标准品色谱图见图１。
　　２．５ 药材的提取方法实验
　　取贵州产漆姑草按照３种不同方法制备的供试品溶液，分别进样２０ μＬ，测定芦丁和槲皮素含量（ｎ＝５），测定平均值，采用水法提取、索氏法提取、乙醇－超声波辅助法提取的芦丁和槲皮素含量如表１。
　　
　　
　　
　　
　　
　　２．６ 重复性实验
　　取同一批漆姑草药材粉末６份，按１．５制备方法进行制备，平行测定，以芦丁和槲皮素的含量为指标，ＲＳＤ为２．２３％和２．１４％，表明方法重现性良好。
　　２．７ 稳定性实验
　　取供试品溶液，分别于０、２、４、８、１２、２４ ｈ测定，结果芦丁和槲皮素峰面积的ＲＳＤ为１．６４％和２．０１％，说明供试品溶液２４ ｈ内稳定性良好。
　　２．８ 方法的精密度和回收率
　　在选定的色谱条件下进行添加回收实验，漆姑草样品分别以０．０１、０．０５、０．１０ ｍｇ／ｋｇ ３个添加水平，按照样品处理方法进行提取、净化，测定芦丁和槲皮素含量，计算回收率。贵州产漆姑草样中芦丁和槲皮素添加回收率在９２．６％～９９．５％，ＲＳＤ（ｎ＝３）为１．７０％～２．７７％，方法的回收率和标准偏差符合国内外有关标准。因此，本方法具有很高的灵敏度与精密度，重现性好、回收率稳定，可以为漆姑草样品中芦丁和槲皮素的测定提供参考。
　　２．９ 样品测定
　　对不同产地的漆姑草样品中的芦丁和槲皮素进行测定，漆姑草样品色谱图见图２，结果见表２。
　　
　　３ 结论
　　本文建立了漆姑草中芦丁和槲皮素的ＨＰＬＣ－ＰＤＡ含量分析的方法。研究结果表明，该方法检出限低、重现性好、精密度高，并且操作简便、快速。
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