蛋白质组学与中医证本质的研究

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　　摘要：通过对中医证本质研究现状的分析，引入蛋白质组学的研究方法，认为蛋白质组学方法在证本质研究中从认知上和技术上都是可行的，有独特的优势；并提出了方证结合、以方测证、以方验证等研究思路与途径。
　　关键词：蛋白质组学；证本质；方证结合
　　中图分类号：R2－03　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)07－1551－03
　　
　　1　证本质研究的现状
　　
　　证是中医辨证论治的核心，是理法方药一脉相承的桥梁和关键，多年来一直是中医研究现代化的突破口。人们普遍认为，抓住了证的研究，就抓住了中医现代化研究的瓶颈。其中证本质的研究是近年来中医学者瞩目的专题，也一直是中医学术界研究的热点，人们试图超越疾病探求证的本质，寻求证的客观指标，认为只要发现和证实了与证有关的特异性物质成分，便揭示了证本质，便可对证进行客观的解释和度量，并可实现中、西两种医学本质上的交汇与融合。
　　因此自20世纪50年代，在中医界全面开展了一场轰轰烈烈的证本质研究，取得了一定的成绩，主要表现在：根据中医文献及临床资料，明确病、证、症的关系，制订某些证的诊断标准，使辨证达到规范化，并将现代医学的实验指标结合到证的研究标准之中；由传统的对临床病人的研究，发展为结合证的动物模型，通过动物模型的研究来与人的辨证研究对照。并结合临床流行病学研究，在脏腑病证的规范化、标准化方面进行了一定探讨。
　　虽然我国在中医证的本质研究方面取得了不少成绩，但是我们并没有揭示证的本质，主要表现在：证候实质研究的传统目标是追求研究指标的高特异性，而其研究结果的特点却恰恰是弱特异性；动物模型研究的局限性；研究思路的片面性等。
　　
　　2　蛋白质组学简介
　　
　　蛋白质组的概念最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkim等于1994年提出的。蛋白质组学(protcomics)是上世纪90年代中期产生的一门新兴科学，它从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控机制的一个新的研究领域。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Expression Proteomics)，细胞图谱蛋白质组学(Cell－Map Proteomics)和功能蛋白质组学(Functional proteumics)。生物功能的主要体现者是蛋白质，复杂的基因间和蛋白质间的相互作用、细胞内的活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工。蛋白质组作为一个在空间和时间上动态变化着的整，体，各个蛋白质之间并非杂乱无章或者相互孤立，而是通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用，密切有序地联系在一起，形成多个子系统，实现特定的生理功能。从基因水平向蛋白质水平的深化，已成为生命科学研究的迫切需要和新的任务。蛋白质组学的建立为研究蛋白质水平的生命活动开辟了更为广阔的前景，提供了新型有效的研究手段。
　　
　　3　蛋白质组学应用于证本质研究的可行性
　　
　　3．1　认知上的可行性　中医理论认为，疾病的发生主要是机体整体功能的失调，证候是疾病在发生发展过程中某一阶段的病理变化实质的概括，是机体内因和环境外因综合作用的机体反应状态，随着病程的发展而发生相应的变化，可见证候有着明显的整体性。蛋白质组学不仅研究蛋白质的构象，更重要的是进一步阐明不同的蛋白质、不同的构象功能的表现。它不是单纯从蛋白的个体进行研究，而是从人体的整个蛋白质，即在蛋白质组的基础上进行研究。因此。蛋白质组学是证本质研究的最佳切入点。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证发生发展的动态变化过程，是在证发生发展过程中产生的特殊物质。蛋白质组学对蛋白质研究的整体观念同中医对疾病认识的整体性有很多的共同之处。采用对整个细胞甚至整个组织的全套蛋白质的蛋白组学研究方法，对证候研究有着重要意义。现代医学也认为疾病的发生大多数是多种病因通过多种途径导致整体功能紊乱的过程，在生命大系统中，如果仅用单因素分析思路来研究多因素系统中的各种关系，往往陷入网络式联系中，难以理出头绪来。因此中医证候理论研究作为中医理论现代化的突破口是理所当然的，而蛋白质组学也是从整体水平上反映了疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，与中医的辨证论治的认识方法相似相通。
　　3．2　技术上的可行性　Patricko Fanell等于1975年建立了双向电泳技术，可同时分离数千种蛋白质。目前应用于蛋白质组学的主要研究技术有：①激光捕获切割技术(LCM)：该技术减少了由于样本成分复杂而造成的干扰或个体差异，提高了样本的均一性；②表面增强激光解吸电离－飞行时间－质谱技术：该方法通过选择性吸附的途径大大降低了样品中蛋白质的复杂性，而同时又保持对多样品、多蛋白的同时分析，从而把每个蛋白放在一个具有相互参照的背景里；③荧光双向差异凝胶电泳(DIGE)：该方法因为采用荧光染料，灵敏度高，故所需样品量非常少，而且一张胶可同时分析3个样品，省去了不同胶之间的匹配问题，减少了工作量，不仅重复性显著提高，而且也提高了分析通量；④蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是把数以万计的蛋白质高密度排列在固相支持物表面，通过探针蛋白特异性的捕捉样品中的靶蛋白，洗去未结合的其他蛋白质，经相应的检测系统即可对靶蛋白进行定性及定量分析。这种技术可以快速、高效、高通量的分析蛋白质组，并能鉴定出蛋白质间的相互作用，利用此技术可以将一个细胞或组织的疾病和健康状态的蛋白质图谱进行比较，找出差异蛋白质，鉴定疾病过程中的标志物，也可通过对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现疾病不同时期的蛋白质标志物，为临床诊断提供量化指标。同时，随着计量化学、统计物理学、信息学的发展，生物信息学家Amos Bai，roch和Appel发展了一种蛋白质专业分析系统，该系统将Geneva 2D gel数据库与SWISS－PROT蛋白质序列数据库联网，帮助研究者从蛋白质序列预测其功能。分析化学的迅猛发展，生物信息技术日新月异的突破，相关学科的交叉渗透，为蛋白组学应用于证研究奠定了技术基础。
　　3．3　蛋白质组学引入证实质研究的优势　首先，证作为相对独立的一个系统，只能用系统的语言来表达。蛋白组学应用于系统的证的研究，通过蛋白质芯片技术或建立蛋白质序列数据库，对各个症状、证进行蛋白质组分分析，明确各种病不同证之间的蛋白质组分的异同，在此分析还原的基础上进行综合归纳，概括其共性与个性。因而，蛋白质组学引入证实质研究，是用一种特殊系统语言对证的实质进行表达。
　　其次，将蛋白质组学引人证实质研究更符合证研究自身的特点。证在相当长的一段时间里一直被误认为是一种

“功能态”，这很大程度上是由于忽略了它的物质性所致。因而，对作为功能的物质载体一蛋白质进行整体性研究，可以跨越了单纯实体结构研究或功能模拟研究证实质的局限性；而且，由于内、外环境的影响，蛋白质的功能表现可表现出一过性或阶段性或持续性的特点，这些特点正符合证功能的活动性、过程性特点。将蛋白组学引人证实质研究，更有利于动态地揭示同一个研究对象不同时期的变动性，更符合证研究自身的特点。
　　再次，将蛋白质组学引入证实质研究，有利促进中医证型实验学的发育。将蛋白质组学引入证实质研究，可从功能表现的具体形式寻找其物质根源－蛋白质组分，然后针对需要模拟的功能形态进行基因－蛋白质的干预。这样能确保功能模拟的准确性和重复性，提高中医证型的实验室研究水平，对中医基础理论研究无疑是巨大的促进。
　　
　　4　证实质研究的思路与途径
　　
　　4．1　证的物质基础应是一组相关物质而非单一特异性物质因此蛋白质组学研究方法是一种有益的尝试要研究证的本质，首先对证要有真正深入的理解。从中西医结合医学的角度来看，中医证本质的含义是指证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的发生发展之动态变化过程，是在证的发生发展过程中产生的特殊物质群。所以，证本质的研究归根结底也是探寻证物质基础的研究。到目前为止，人们对证先后提出了十几种定义，但仍对其内涵和外延没有得到一个明确统一的界定。如果我们暂不考虑证的定义，只从中医临床辨证的方法就可以看出，证实际上是外在疾病征象的某种排列组合，是症状和体征的集合，有集合论“群”的特征。再者，中医脏腑不单纯是一个脏器，包含着现代医学意义上的多个系统的功能。例如。肾虚证就可能涉及到泌尿系统、生殖系统等多脏器、多系统的生理和病理变化。中医学认为“有诸于内，必形诸于外”，现代医学也认为结构和功能是统一的，有结构改变就会有其功能表现，有功能改变就必有其结构基础。因此，根据以上分析我们可得出以下构想：呈现某证患者的机体内必然有引发该证一系列症状和体征的物质基础，且分布于机体各组织脏器中；正是由于存在于机体各组织脏器中的这些物质基础的某种改变引发了中医的各种证候。因而，证候物质基础不会集中在某一脏器，也就更不会是单一的特异性物质。
　　4．2　方证结合　以方测证以方验证是研究证本质的有效途径中医是以方治证，尽管中医理论博大精深，哲理性强，但在临床诊断上，无论是八纲辨证、脏腑辨证、气血津液辨证、卫气营血辨证、三焦辨证、还是六经辨证，最后的治疗都要落实到相应的方剂上去。
　　据此可以设想，中医的每一个证候最终都有相应的方剂可以给予治疗，如果该证候没有相应的治疗方剂，则该证候的命名和研究也就失去了意义。因为研究证候的最终目的是为了指导临床精确选方用药，不应存在只有名称而无相应治疗方剂的证候。如果此论可立，那么就可将某一方剂在治疗相应证候的患者或动物模型时所调节与纠正的那些物质视为该证候的物质基础。因为正是该方剂在机体内发挥其药理作用的过程中调节与纠正了这些物质后，才使该证候的临床症状得以缓解或消失。因此，方证结合、以方测证、以方验证是研究证本质的有效途径。
　　4．3　蛋白质组学和代谢组学是适用的技术手段　由于方剂一般由多味中药组成，其组分复杂，又是多靶点、多环节、多层次的整体性药理机制，对机体各个组织脏器有着广泛的调节作用。因此，方剂进人体内调节与纠正的物质应存在于机体各个组织脏器中。蛋白质组学和代谢组学的出现，使寻找这些物质有了可能。只要比较某方剂在治疗相应证候前后机体各组织脏器蛋白质组学、代谢组学的图谱，找出发生变化的那些物质，便可视其为该证候的物质基础。
　　蛋白质组学对蛋白质研究的整体观念同中医对疾病认识的整体性有很多的共同之处，蛋白质组学从整体水平上反映了疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，与中医的辨证论治的认识方法相似相通，因此蛋白质组学是研究证本质的适宜技术手段。
　　
　　5　展望
　　
　　在短短的几年内，蛋白质组学的技术和方法有了很大发展，并不断与其他学科相整合，一个不断成熟的蛋白质组学方法技术体系正在形成。我们有理由相信，蛋白质组学的应用将不断扩大，对中医证候的本质研究将进入更加深入，更加全面的阶段，将推动从细胞和分子水平上探讨人类重大疾病的机制、诊断、防治，为新药开发提供重要的理论基础，为中医药的研究开辟一个崭新的局面。

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