HPLC法测定湿疹洗剂中苦参碱的含量
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摘要：目的 建立HPLC法测定湿疹洗剂中苦参碱的含量。方法 采用C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）色谱柱;流动相为：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（10：10：80）为流动相;流速1.0 mL/min;检测波长215nm。结果 苦参碱的线性范围为0.55～2.75μg，r=0.9997，平均回收率为99.53%，RSD=1.47%.结论 该方法简便、准确，重复性好，回收率高，可作为湿疹洗剂的质量控制方法。
关键词：湿疹洗剂;苦参碱;HPLC
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章編号：1007-2349（2019）03-0068-03
湿疹是一种可在一年四季内发生的常见疾病，可以发生在任何年龄组，其发病机制复杂，它是由内因与外因相互作用，以及浅表表皮和真皮的炎症性皮肤病引起的，多发于头部和脸部、肩部、胸部等部位。该病多为对称分布，常伴有严重瘙痒等症状，病情复杂，时间长，易复发。近年来，湿疹患者逐年增多[1]。目前尚无有效的治疗方法，中医药在湿疹治疗方面取得了一定的成效，显示出自身的优势。湿疹洗剂系临床经验方，由苦参、炒黄柏、生地、炒白术等10味中药组成的复方制剂，具有清热燥湿，祛风止痒的作用，临床上用于湿疹疥廯引起的皮肤瘙痒等病症。方中苦参为主药，具有清热燥湿、杀虫、利的功效[2]，据报道，苦参水煎液和苦参碱均有显著的抗炎作用。许多临床资料证明，苦参碱的抗炎机制与其抑制磷脂酶A2（PLA2）活性有关。国内外专家已证实苦参对急慢性瘙痒模型有止痒作用。此外，氧化苦参碱注射液治疗急性和亚急性湿疹的总有效率为94%，慢性湿疹的总有效率为79%[3]。黄柏是芸香科黄檗和黄皮树的干树皮，味苦性寒，归肾、膀胱和大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、退热的功能。现代中药研究发现，黄柏中含有多种生物碱，主要为小檗碱，其余为黄柏碱、黄柏酮、黄柏内酯、白鲜内酯、药根碱、木兰花碱、掌叶防己碱等[4]，具有抗细菌毒素、抗炎、抗高血压和利尿作用。其中小檗碱对金黄色葡萄球菌等有较强的抑制作用，而金黄色葡萄球菌是湿疹的主要细菌，在某些湿疹的发生、维持和加重中起作用[5]。黄柏中小檗碱能显著降低金黄色葡萄球菌毒素的产生，促进细菌对白细胞的吞噬作用，减少炎症的损伤[6]。因此，为了有效控制湿疹洗液的质量，确保制剂的有效性和安全性，以苦参碱作为指标成分，采用高效液相色谱法直接测定苦参碱，结果满意，特异性强，操作简便，内容报告如下。
1 仪器与试药
Agilent高效液相色谱仪（四元泵，DAD检测器，自动进样器），Agilent1200化学工作站;FA1104电子分析天平（上海精科天平厂）。HN1006型超声波清洗机（广州华南超声设备厂生产）。苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：：160805-200508）;湿疹洗剂（系自制）;水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6mm，5 μm）;流动相：甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（10：10：80）;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃;检测波长：215nm;进样量10μl。在此条件下，苦参碱与其他色谱峰分离良好，理论板数以苦参碱峰计算，应不低于3000.
2.2 对照品溶液的制备 取苦参碱对照品适量，精密称定苦参碱2.750mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（0.11mg/ml）[7].
2.3 供试品溶液制备 取本洗剂，摇匀，精密吸取5 mL，加浓氨试液2 mL，用三氯甲烷50ml萃取3次，合并三氯甲烷，蒸干，残渣用甲醇溶解后转移至25 mL量瓶中，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液即得[8]。
2.4 阴性对照试验 按处方取缺苦参的阴性对照药，按供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液，进样，依法测定，结果阴性对照液在相同位置处无与苦参碱相对应的色谱峰，表明处方中其它药材和辅料不干扰苦参碱的测定。
2.5 线性关系的考察 分别精密吸取对照品溶液5，10，15，20，25μL进样，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，苦参碱的回归方程为Y=4315.3X+147，r=0.9997，表明进样量在0.55～2.75μg范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验 精密吸取上述对照品溶液10μL，按照上述色谱条件连续进样5次，测定阿魏酸峰面积值，计算苦参碱RSD为1.52%（n=5），表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，8，24 h测定苦参碱峰面积，结果RSD为1.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 重复性实验 精密称取同一批次的样品6份，按照供试品溶液制备方法得到供试品溶液，依上述色谱条件测定苦参碱的含量，其RSD为1.93%，表明本方法重复性良好。
2.9 加样回收率实验 采用加样回收法测定，取已知含量的样品（批号：170810），精密移取5 mL，精密加入苦参碱对照品适量，制成各自的供试品溶液，依法测定，计算加样回收率。结果见表1。
2.10 样品测定 取3批样品，分别精密移取本品5 mL，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，10μL进样。结果见表2。
3 讨论
根据苦参的生质，笔者参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）收载的苦参原药材含量测定项下的色谱条件，采用乙腈‐无水乙醇‐3%磷酸溶液（80：10：10）[9]进行了试验，结果表明供试品中苦参碱峰与其他杂质峰达不到基线分离。笔者根据文献报道[10，11]，选择了3种流动相：①乙腈-水（加水0.04%三乙胺，磷酸调pH至7.00（20：80）;②乙腈-0.05%磷酸溶液（5：95）;③甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（10：10：80）。经多次测试结果表明，前两种流动相所得峰形较宽，含杂质多，而采用③甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液（10：10：80）为流动相所得样峰形好，干扰成分少，在此流动相条件下，峰形及分离度均良好，能满足湿疹洗剂中苦参碱的含量测定要求，故选此作为含量测定的流动相。我们研究了样品的制备方法。开始将样品溶液经水稀释过滤后，按照上述的色谱条件进样测试，结果干扰成分较多，严重影响了苦参碱等成分的分离。接下来，我们把样品用氨水碱化，目的是增加生物碱的脂溶性，然后用氯仿萃取，生物碱与其他成分分离，大大提高了纯化效果，苦参碱的分离效果较好，同时也简化了文献[12]中样品的前处理方法。
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