Lgr5、TFF2在萎缩性胃炎及低级别上皮内瘤变中的表达及临床意义

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　　[摘要] 目的 探讨Lgr5、TFF2在萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变中的表达及临床意义。 方法 随机选取2018年1～6月在湖北省中医院病理科确诊为萎缩性胃炎的胃镜活检蜡块30例、低级别上皮内瘤变的20例，采用免疫组织化学实验检测Lgr5、TFF2蛋白表达情况。 结果 Lgr5、TFF2蛋白表达均为阳性，Lgr5在低级别上皮内瘤变中的表达水平高于萎缩性胃炎，但两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;TFF2在低级别上皮内瘤变中的表达水平低于萎缩性胃炎，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 Lgr5、TFF2的表达与胃癌前病变的病理严重程度相关，可作为潜在预测胃癌发生、发展、预后的重要生物学标记。
　　[关键词] Lgr5;TFF2;萎缩性胃炎;低级别上皮内瘤变;胃癌前病变
　　[中图分类号] R573.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）12-0020-04
　　Expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia
　　WEN Na1 HU Yunlian2
　　1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China; 2.Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430061， China
　　[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of Lgr5 and TFF2 in atrophic gastritis and low-grade intraepithelial neoplasia. Methods Thirty gastroscopic biopsy waxes diagnosed as atrophic gastritis and 20 waxes of low-grade intraepithelial neoplasia treated in our hospital from January to June 2018 were randomly selected. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Lgr5 and TFF2 proteins. Results The expression of Lgr5 and TFF2 protein were positive. The expression level of Lgr5 in low-grade intraepithelial neoplasia was higher than that in atrophic gastritis， but there was no significant difference between the two groups（P>0.05）. The expression level of TFF2 in low-grade intraepithelial neoplasia was lower than that in atrophic gastritis， and the difference was significant （P<0.05）. Conclusion The expression of Lgr5 and TFF2 is related to the pathological severity of gastric precancerous lesions， and can be used as an important biomarker for predicting the occurrence， development and prognosis of gastric cancer.
　　[Key words] Lgr5; TFF2; Atrophic gastritis; Low-grade intraepithelial neoplasia; Gastric precancerous lesions
　　胃癌是世界范圍内高发病率、高死亡率的癌症之一，尽管有先进的诊断工具和治疗方法，其5 年生存率仍低于30%[1]。肠型胃癌的发病是多因素、多步骤的病理过程，目前认可的病理变化是：慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→上皮内瘤变→肠型胃癌，其中萎缩性胃炎是癌前疾病，而肠化、上皮内瘤变是癌前病变。近年来研究发现肿瘤可能起源于干细胞，胃肠道干细胞是存在于胃肠道组织中的成体干细胞，能分化形成各种胃肠道上皮细胞，目前可通过识别细胞表面标志物如CD44、CD133、TFF2、Lgr5等方法研究胃癌及癌前状态的相关分子表达水平。本次实验拟通过检测Lgr5、TFF2在萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变中的表达情况，来推测Lgr5、TFF2蛋白表达与胃癌发生的关系，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源
　　标本来自病理科2018年1～6月湖北省中医院病理科归档的蜡块，随机法从中选出病理诊断为萎缩性胃炎的病例30例，其中男16例，女14例，年龄25～68岁，平均（51.5±8.13）岁;低级别上皮内瘤变病例20例，其中男10例，女10例，年龄24～73岁，平均（51.7±11.3）岁;每个指标每例1张，共计50*2张，每例标本均经本院资深的病理医师行病理学诊断，病理资料齐全。 　　1.2 方法与试剂
　　DAB浓缩型试剂盒、苏木素、中性树胶均购自bioswamp公司，Lgr5多克隆兔抗体（工作浓度1：25）、TFF2多克隆兔抗体（工作浓度1：40）均购自Abcam公司。Lgr5阳性信号定位在细胞质和细胞核，TFF2阳性信号定位在细胞质和（或）细胞核。
　　1.3主要仪器
　　OLYMPUS正置显微镜、移液器、恒温烘箱、石蜡切片机、摊片机、IMS图像分析系统。
　　1.4免疫组织化学染色
　　采用免疫组化SP法，抗原修复采用高压热修复。每组染色均以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性组织作为阳性对照。具体实验步骤如下：4 μm厚的石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液高压修复、3% H2O2室温孵育阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗。滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗室温孵育，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。
　　1.5结果判定
　　由2位病理科医师在未知临床病理资料下读取结果，并协商取得统一。判定方法参考黄江龙等[2]、江晓红等[3]等采用的方法。Lgr5阳性定位为细胞质和细胞核，以细胞核为主，有棕褐色或棕黄色着色者为阳性，TFF2阳性定位为细胞质和（或）细胞核，以细胞核为主，有棕褐色或棕黄色着色者为阳性。先按染色强度计分，0分为无色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为深黄色;高倍镜下随机选取5个镜野，计算500个细胞，按阳性细胞数占所计数的同类细胞数的比率，将结果分为4个等级，0级为阴性，计0分，1级为阳性细胞<20%，计1分，2级为阳性细胞20%～50%，计2分，3级为阳性细胞>50%，计3分;最后根据染色强度与阳性细胞比率等级的乘积分，为阴性0分（-），1～2分弱阳性（+），3～6分中度阳性（++），7～9分强阳性（+++）。
　　1.6 统计学方法
　　应用SPSS20.0统计软件，用秩次表示Lgr5、TFF2蛋白在不同胃黏膜中表达强度，等级资料采用非参数Wilcoxon mann-Whitney U秩和检验，检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 Lgr5、TFF2蛋白的表达与胃黏膜病变的关系
　　Lgr5的反应物呈黄色或棕黄色，主要位于细胞核，萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变中Lgr5的表达见封三图1、2，兩者比较，差异无统计学意义（P=0.49>0.05），见表1;TFF2的反应物呈黄色或棕黄色，位于细胞核、细胞质，主要在细胞核，TFF2在萎缩性胃炎、低级别瘤变中的表达见封三图3、4，两者比较，差异有统计学意义（P=0.03<0.05）。见表2。
　　2.2 不同胃黏膜中Lgr5、TFF2蛋白的表达强度与性别、年龄的关系
　　萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变中Lgr5、TFF2蛋白的表达与年龄、性别的关系比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3～6。
　　3讨论
　　富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体5（Lgr5）是由18个富含亮氨酸的重复单位和 7个跨膜区域组成的G 蛋白偶联受体，其分布广泛，在大脑、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃肠道等均有表达[4-7]，已有研究发现Lgr5为Wnt信号通路的下游靶向基因，可作为胃、肠、毛囊等部位的干细胞标记物[8];体内的细胞谱系示踪技术和体外培养系统研究[9]表明Lgr5+细胞是局限于胃窦腺体基底部的成体干细胞，是胃黏膜上皮更新的源泉，可维持正常数量的胃黏膜上皮细胞及腺体，提示Lgr5是胃多能干细胞的标志物。研究发现在新生的胃中，Lgr5主要在胃体及幽门腺体底部表达，但在成熟的胃中，Lgr5局限于幽门腺体底部[9-10]。在病理状态下，如浅表性胃炎、胃溃疡、胃癌中Lgr5的表达部位分别是在黏液颈区域、管腔表面、肿瘤中央和侵袭部位前面[11];研究发现Lgr5与多种癌症相关，如结直肠癌[12]、原发性肝癌[13]、胃腺癌[2]、子宫颈鱗状细胞癌[14]。Xiu-Bin Li等[15]发现胃Lgr5+干细胞是致癌细胞，并可能作为癌症传播细胞，使之恶化。本研究发现Lgr5在萎缩性胃炎中主要表达于胃小凹及萎缩区域附近的腺体;在低级别上皮内瘤变中主要表达于腺体底部，且腺腔基底侧的染色强度高于腔面侧，两组比较，Lgr5在低级别上皮内瘤变中的表达强度高于萎缩性胃炎，进一步提示Lgr5有促进胃黏膜病变加重的作用，可能是一种促进炎症发展的因子，但两组比较无统计学意义，考虑此次样本量较少，后续应增加样本量，进一步研究Lgr5在不同胃黏膜中的表达情况。
　　TFF家族成员包括TFF1、TFF2、TFF3，是一种小肽分子，因其形状类似三叶草，故称为TFF，其中TFF2在胃、十二指肠特异性表达，具有减少胃酸分泌、与黏液蛋白结合形成保护屏障、促进损伤组织修复的功能，从而起到保护胃黏膜的作用。生理情况下TFF2主要表达于胞质，在胃黏膜上皮、表面黏液层、胃腺细胞和胃小凹中可见，病理情况下如消化性溃疡、胃癌时，TFF2分别在胃溃疡的基底部及边缘，慢性萎缩性胃炎的黏膜表面、萎缩腺体及肠上皮化生的周围表达增强[16]。当损伤因子加重，或保护因子减少，则黏膜进一步受损。周学文等[17]发现 TFF2的表达在浅表性胃炎中低、在糜烂性胃炎中次低，在胃溃疡中最低，病情轻重程度与TFF2的表达呈负相关，说明TFF2可作为一种保护性因子。宋洁等[18]发现正常胃黏膜组织中 TFF2为阳性表达，表达率为100%，而在肠化生、异型增生以及胃癌组织中，其阳性表达率依次逐渐下降。
　　本次研究发现TFF2在萎缩性胃炎中主要表达于腺体底部，靠近萎缩区域;在低级别上皮内瘤变中主要表达于腺体颈部，腺腔基底侧的染色强度高于腔面侧;两组比较，TFF2在萎缩性胃炎中的表达强度高于低级别上皮内瘤变，且有统计学意义。此次研究提示TFF2可作为胃黏膜的保护因子，或许在胃黏膜病变时可给予外源性TFF因子以利于胃黏膜的修复。 　　综上所述，通过本次研究发现Lgr5、TFF2在萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变中的表达情况不同，一方面间接验证了Correa级联学说的部分内容;另一方面有助于临床上更准确的判断癌前病变严重性及预后，也为研究治疗肿瘤的靶向药物提供了新的思路。但本次实验样本量偏少，且因使用的是胃黏膜活检蜡块，取材浅，黏膜各层次无法全部展示，后续实验拟增加样本量，或进行动物实验，以进一步明确Lgr5、TFF2在不同胃黏膜中的表达情况及其临床意义。
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　　（收稿日期：2018-11-05）
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