DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展

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　　[摘要]非结核分枝杆菌（NTM）感染的患者数量逐年增加，同时，NTM新的亚种不断被发现，这导致其检测鉴定难度也随之增加。迄今发现的菌种已有160余种，而传统检测方法（培养基培养后辅以生化试验）不能准确、及时地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的迅速发展，利用NTM同源DNA序列中的特异性（如16S核糖体DNA、核糖体蛋白S1、转录间区序列1、热休克蛋白65、rpo B等）可以快速鉴定菌种。使用DNA序列进化树聚类分析或DNA序列数据库比对，能够快速、准确鉴定NTM。单一的分子标识技术对NTM的鉴定不能达到种及亚种水平，采用多重的分子标识组合技术能在一定程度上完善单一分子标识鉴定菌种的不足之处，因此，可提高菌种鉴定水平的多重分子标识技术值得构建。
　　[关键词]非结核分枝杆菌;DNA测序;鉴定
　　[中图分类号] R372          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）7（c）-0030-04
　　[Abstract] The number of patients with nontuberculous Mycobacteria （NTM） infection increased year by year. Meanwhile， new subspecies of NTM were continuously discovered， which led to the increased difficulty in detection and identification. So far， more than 160 species have been discovered. Traditional methods of testing （supplemented with biochemical tests ） can not provide accurate and timely reference for clinical diagnosis. With the rapid development of molecular biology techniques， the specificity of NTM homologous DNA sequences （such as 16S rDNA， rps A， ITS-1， heat shock protein 65， rpo B， etc.） can be used to rapidly identify bacterial species. Using DNA sequence evolutionary tree clustering analysis or DNA sequence database comparison can rapid and accurate identification of NTM. The identification of NTM by single molecular marker technology can′t reach the level of species or subspeciesl， and the application of multiple molecular combination technology can improve the shortcomings of single molecular marker identification to some extent. Therefore， it is worthwhile to construct  multiple molecular identification techniques that can improve the level of strain identification.
　　[Key words] Nontuberculous Mycobacteria; DNA sequence; Identification
　　非結核分枝杆菌（nontuberculous Mycobacteria，NTM）系指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的一大类分枝杆菌的总称。NTM种类繁多，迄今已发现160余种，通常采用Runyon分类法（NTM在试管内的生长温度、速度、菌落形态和色素产生与光反应关系）将NTM分为光产色菌、暗产色菌、不产色菌及快速生长分枝杆菌4组[1]。NTM广泛存在于自然环境中，主要通过水和土壤传播，极少数为致病菌，多数为条件致病菌，人通过环境接触感染NTM而患病[2-3]。近期的研究显示，NTM的分离率由4.3%（1979年统计）上升至11.1%（2000年统计），再到21.0%（2010年统计）[4]，这反映出我国的NTM病患者呈明显增多趋势。NTM病与结核病的临床表现相似，多表现为全身中毒症状和局部损害，主要累及肺、淋巴结、皮肤及免疫受损患者，若能及时鉴定出菌种甚至亚种，可减少误诊，进而降低因误诊导致的不良后果[2，5]。不同种类NTM感染采用的治疗方案亦不同，因此，明确NTM是否感染及鉴定出准确的亚种是拟定最佳诊疗方案的关键。
　　NTM的实验室检测方法主要是传统细菌学检测和分子生物学检测，传统检测方法（培养基培养后辅以生化试验）因简单、试剂价格合理且易于推广而被沿用至今，但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性，不能准确、及时地为临床诊断提供参考[6]。随着分子生物学技术的迅速发展，利用NTM同源DNA序列中的特异性可以鉴定其菌种甚至亚种，这为临床诊断提供了确切依据，其由于快速、高效、特异等优点而受到青睐。本文对DNA测序鉴定NTM菌种的研究进展进行论述。 　　2 DNA序列比较法鉴定NTM
　　2.1 DNA序列进化树聚类分析
　　将已知的所有的NTM某一同源DNA序列通过DNA序列分析软件进行排序、比较，建立该DNA序列的进化树，在进化树中加入待鉴定的NTM的同源DNA序列进行聚类分析，最终鉴定出待检测的菌种[19]。由于某些NTM不同DNA序列在遗传进化树中位置不完全一致，单个DNA序列携带的遗传信息有限，因此单一DNA序列聚类分析增加结果的不确定性与不同同源序列的进化速度不一致有关。有学者应用多位点序列分析（multi locus sequence analysis，MLSA）进行人为的串联重组，建立多位点DNA序列遗传系统的进化树进行聚类分析，使遗传系统的进化树聚类分析更可靠[20-22]。DNA序列数据库的正确和完整对DNA序列进化树聚类分析方法的优劣关系密切。目前尚未建成一个完整的具备所有种类NTM DNA序列的数据库，包括标准菌株和各种变异株。采用进化树进行聚类分析操作的过程复杂，对操作人员要求较高等因素限制了该技术的广泛应用。
　　2.2比对DNA序列数据库
　　DNA序列数据库的出现让DNA序列对比鉴定NTM变得相对容易，在一些开放的公共数据库平台上，共享不同研究机构的数据，增加了数据库信息量及完整性，如美国的国家生物信息中心（NCBI）的基因银行，可使用基本局部比对搜索工具（BLAST）对大部分DNA序列进行对比菌种鉴定[23]。对于普通的使用者，通过数据库中的BLAST对比鉴定，结果可靠。然而NCBI存在一些鉴定长度不全的序列、错误的序列和部分未命名的序列，这些均会对鉴定结果的准确性产生影响，尤其是NCBI数据库中部分菌种含有的序列信息有限时，错误序列将对鉴定结果造成较大影响。
　　高质量的数据库对DNA序列比对鉴定结果的正确性意义重大，如可专一鉴定16S rDNA的MicroSeq数据库[24]和针对ITS的MycoAlign数据库[25]。此外，还有NCBI建立的针对hsp65的专用数据库[26]以及针对16S rDNA与rpo B联合分析的RipSeq数据软件[27]。各种高质量数据库在减少碎片化序列与错误序列存在的同时，提高了鉴定的准确性，然而一些新增的NTM菌种和专一数据库中菌株突变DNA序列对数据库质量带来了很多困难。及时更新、完善新增菌种和种内突变株的DNA序列是高质量专一数据库发展的关键。
　　3小结与展望
　　NTM感染的患者数量逐年增长，快速、准确的诊断有助于临床治疗选择有效的治疗方法。但是，NTM不同亚种存在高度相似的DNA同源性，导致单一标识技术不能将所有分枝杆菌鉴定至亚种水平，多重分子标识组合技术在一定程度弥补了单一标识技术鉴定的缺陷，因此，构建多重分子标识组合的技术可提高鉴定亚种的水平。多个DNA序列联合应用可提高对菌种的鉴别能力，但因技术复杂且目前相关研究较少，相应的基因数据库不完善限制了其应用范围。随着基因数据库的进一步完善，多重分子标识组合检测技术的成熟，NTM感染将实现快速、准确的诊断，能夠尽早、有效地治疗，最大限度地改善患者预后。
　　[参考文献]
　　[1]唐神结.非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识解读[J].中国医刊，2016，51（3）：21-24.
　　[2]中华医学会结核病学分会，《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会.非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识[J].中华结核和呼吸杂志，2012，35（8）：572-580.
　　[3]许光辉，黄燊德，赵柳婵.233例非结核分枝杆菌肺病的临床分析[J].中国医学创新，2015，12（13）：115-117.
　　[4]王宇.全国第五次结核病流行病学抽样调查资料汇编[M].北京：军事医学科学出版社，2011：15-18.
　　[5]Henkle E，Winthrop KL.Nontuberculous Mycobacteria infections in immunosuppressed hosts[J].Clin Chest Med，2015，36（1）：91-99.
　　[6]李地灵，陈晋.非结核分枝杆菌感染的实验室鉴定方法学进展[J].国际检验医学杂志，2013，34（14）：1840-1842.
　　[7]刘晶波，乐军，韩敏，等.分枝杆菌快速鉴定分子技术研究进展[J].国际呼吸杂志，2009，29（18）：1149-1152.
　　[8]Duan HF，Liu G，Wang XB，et al.Evaluation of the ribosomal protein S1 gene （rps A） as a novel biomarker for Mycobacterium species identification[J].Biomed Res Int，2015，2015：1-8.
　　[9]Shojaei H，Abodolrazagh H，Heidarieh P，et al.Molecular identification of rare clinical Mycobacteria by application of 16S-23S spacer region sequencing[J].Iran J Basic Med Sci，2012，15（1）：661-668.
　　[10]Gürtler V，Harford C，Bywater J，et al.Direct identification of slowly growing Mycobacterium species by analysis of the intergenic 16S-23S rDNA spacer region （ISR） using a GelCompar Ⅱ database containing sequence based optimization for restriction fragment site polymorphisms （RFLPs） for 12 enzymes[J].J Microbiol Methods，2006，64（2）：185-199. 　　[11]Maiorova AA，Stepanshina VN，Shemiakin IG，et al.Study of collections of Mycobacterium non-tuberculosis by a restriction test of the amplifiedfragment spacer sequence 16S-23S of ribosomal DNA[J].Probl Tuberk Bolezn Legk，2004，（11）：34-37.
　　[12]Kim H，Kim SH，Shim TS，et al.Differentiation of Mycobacterium species by analysis of the heat-shock protein 65 gene （hsp65）[J].Int J Syst Evol Microbiol，2005，55（Pt 4）：1649-1656.
　　[13]Li YB，Zhang YY，Hhang MX，et al.Rapid identification and differentiaion of the species of the Mycobacterium chelona/abscessus complex by hsp65 and rpoB PCR-RFLP[J].Chin J Zoonoses，2012，28（7）：645-652.
　　[14]Hoza AS，Mfinanga SG，Rodloff AC，et al.Increased isolation of Nontuberculous Mycobacteria among TB suspects in Northeastern，Tanzania：public health and diagnostic implications for control programmes[J].BMC Res Notes，2016，17（9）：109.
　　[15]王洪秀，乐军.分枝杆菌分子鉴定中常用的靶基因序列的研究进展[J].中国防痨杂志，2009，31（8）：491-494.
　　[16]尹小毛，林丽，毛欣茹，等.非结核分枝杆菌临床株rpo B基因多态性分析[J].现代诊断与治疗，2016，27（12）：2159-2162.
　　[17]Hadifar S，Moghim S，Fazeli H，et al.Molecular typing of Iranian Mycobacteria isolates by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of 360-bp rpo B gene[J].Adv Biomed Res，2015，27（4）：152.
　　[18]王亚娟，冯萍，熊礼宽.分枝杆菌鉴定的分子生物学方法研究进展[J].临床肺科杂志，2009，14（3）：353-355.
　　[19]黄明翔.非结核分枝杆菌病的实验室诊断技术进展[J].中国防痨杂志，2013，35（7）：538-541.
　　[20]Jang MA，Koh WJ，Huh HJ，et al.Distribution of Nontuberculous Mycobacteria by multigene sequence-based typing and clinical significance of isolated strains[J].J Clin Microbiol，2014，52（4）：1207-1212.
　　[21]Hashemi-Shahraki A，Bostanabad SZ，Heidarieh P，et al.Species spectrum of Nontuberculous Mycobacteria isolated from suspected tuberculosis patients，identification by multi locus sequence analysis[J].Infect Genet Evol，2013，12（20）：312-324.
　　[22]魏劍浩，郭倩，李桂莲，等.马西利亚分枝杆菌临床分离株的多位点序列鉴定和药物敏感性试验分析[J].中国防痨杂志，2015，37（3）：300-306.
　　[23]聂文娟.非结核分枝杆菌的菌种鉴定、药敏试验和耐药机制的研究[D].北京：北京市结核病胸部肿瘤研究所，2014.
　　[24]Hall L，Doerr KA，Wohlfiel SL，et al.Evaluation of the MicroSeq system for identification of Mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory[J].J Clin Microbiol，2003，41（4）：1447-1453.
　　[25]Mohamed AM，Kuyper DJ，Iwen PC，et al.Computational approach involving use of the internal transcribed spacer 1 region for identification of Mycobacterium species[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3811-3817.
　　[26]Dai J，Chen Y，Lauzardo M.Web-accessible database of hsp65 sequences from Mycobacterium reference strains[J].J Clin Microbiol，2011，49（6）：2296-2303.
　　[27]Simmon KE，Kommedal  ，Saebo ，et al.Simultaneous sequence analysis of the 16S rRNA and rpoB genes by use of RipSeq software to identify Mycobacterium species[J].J Clin Microbiol，2010，48（9）：3231-3235.
　　（收稿日期：2019-01-02  本文编辑：祁海文）
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