人乳头瘤病毒检测方法及其应用进展

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　　[摘要] 宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，早发现、早治疗是预防宫颈癌的关键。除细胞学检查外，HPV检测也是宫颈癌筛查的重要方法。最初的HPV检测方法主要是基于形态学，如细胞学、组织学、免疫组化及电镜等，但因敏感度和特异度均不理想，操作较繁琐，临床使用较少。目前应用于临床的HPV检测方法为基于现代分子生物学的核酸技术，灵敏度及特异度均较高。该文就国内、外普遍应用的HPV检测方法及其应用进展作一简述。
　　[关键词] 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;人乳头瘤病毒;检测
　　[中图分类号] R737          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）07（a）-0196-03
　　Progress in Detection of Human Papillomavirus and Its Application
　　PENG Cai-jiao， XIONG Zheng-ai
　　The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing， 400010 China
　　[Abstract] Cervical cancer is a common malignant tumor in women. Early detection and early treatment are the key to prevent cervical cancer. In addition to cytology， HPV testing is also an important method for cervical cancer screening. The original HPV detection method is mainly based on morphology， such as cytology， histology， immunohistochemistry and electron microscopy， but the sensitivity and specificity are not ideal， the operation is cumbersome， and the clinical applications are fewer. The current HPV detection method applied to the clinic is based on modern molecular biology nucleic acid technology， and the sensitivity and specificity are high. This paper gives a brief introduction to the domestic and foreign HPV detection methods and their application progress.
　　[Key words] Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Human papillomavirus; Detection
　　目前宫颈癌仍严重威胁全球女性的生命健康，仍是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一[1]，世界范围内宫颈癌居女性恶性肿瘤第4[2]，每年约有50万的新发病例，每年死亡病例超过26万，均主要发生于社会经济欠发达地区[3]。随着宫颈癌细胞学检查联合HPV检测的筛查模式的推广及逐渐普及，全球宫颈癌的死亡率和发生率下降明显，但在发展中国家尤其是中低收入国家有上升趋势，数据显示我国则有逐渐上升[4]。
　　长期以来宫颈癌筛查以细胞学检查为主，随着HPV感染和宫颈肿瘤之间的直接因果关系被證实[5-7]，HPV检测逐渐成为宫颈癌的重要部分。HPV检测虽特异性较低，但高敏感性、高阴性预测值等特点更突出，近期研究提出，联合筛查在预防宫颈癌发挥的重大意义可能在于HPV检测[8]，HPV检测在预防宫颈癌方面可提供更多的保护[9]。该文将对以下HPV检测方法及其应用进展作一简述。
　　1  HPV DNA检测
　　1.1  杂交捕获（Hybrid Capture，HC）技术
　　HC-II技术1999年成为美国FDA认证的第一个用于宫颈癌筛查的HPV检测方法，基因杂交基础上利用化学发光对抗体捕获的信号放大原理，对高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型进行检测，并可进行病毒载量半定量检测，因有统一的临床判定标准，检测结果客观性较高，且重复性好，采用HPV全长碱基对设计避免了因灵敏度过高导致的假阳性，无需基因扩增有效避免环境因素造成的假阴性。研究显示HC-II法对CIN2及以上病变的敏感度及特异度分别为97.1%和85.6%[10]，因此HC-II法至今被作为HPV检测的金标准，但该方法不能具体分型、缺乏内质控，且成本高，与低危型HPV型也存在交叉反应[10-11]。
　　careHPV检测是一种宫颈癌快速筛查技术，2018年8月获世界卫生组织资格认证。careHPV检测同样基于HC-II的原理，但除能检测常见13种高危型HPV外，还能检测HPV 66型，且操作简易、价格低廉、检测用时短，因此，该方法被认为非常适用于卫生资源匮乏地区等发展中国家，包括中国农村。临床结果显示，CcareHPV对CIN2及以上病变的灵敏度为90%，特异度为84.2%，与HC-II检测接近[12]。
　　1.2  Invader 酶切信号放大法 　　该方法采用Invader专利技术，通过分子杂交和化学信号放大，直接检测特定HPV DNA序列。2009年美国FDA批准使用的Cervista HPV检测则基于该方法，对HPV DNA的L1、E6/E7区进行检测，这可避免仅检测L1区所造成的假阴性，且与多数低危型HPV无交叉反应，降低了假阳性率[13]，也能进行内质控，其有两种试剂盒：Cervista HR HPV和Cervista HPV16/18，前者能检测14种高危型HPV，并将其分为A5/6、A7、A9 3组，但认为分组检测的临床意义尚不能明确[14]，后者可对HPV16/18分型。Belinson等在中国广东省纳入1万女性的研究中Cervista HR HPV对CIN3及以上病变的灵敏度为95.1%（95%，90%～98%），与HC-II法无明显统计学差异，但特异度显著高于HC-II法（P<0.05）[15]。
　　1.3  聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术
　　这类方法多样，包括常规PCR技术、实时荧光定量PCR技术、PCR-酶联免疫吸附测定检测技术、PCR结合返向杂交技术等。2011年获FDA批准用于宫颈癌筛查的Cobas 4800 HPV检测则以实时荧光定量PCR技术为基础，可检测14种高危型HPV，并提供HPV16、18同步基因分型，但对余12种不能具体分型，敏感性和特异性均较高，且不存在与低危型HPV的交叉反应，但因敏感性过高，易导致假阳性率的增加。Mark等[16]的研究显示，Cobas 4800 HPV检测在灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值方面与HC-II法无明显差异，且两者一致性高，在CIN2以下和CIN2及以上的病变中的一致性分别为90.6%（95%，89.1%～92%）和96.2%（95%，89.5%～98.7%）。Lapierre等[17]研究发现，Cobas 4800 HPV检测的重复性较好，多次检测的一致率较高，降低了操作成本，同时能对是否行阴道镜下活检提供有效帮助信息。基于ATHENA的研究结果[18]，2014年Cobas 4800 HPV检测成为美国FDA唯一批准用于25岁女性宫颈癌一线初筛的HPV 检测方法。随着国内外学者深入探索，发现HPV自取样技术的参与率高于细胞学筛查，群众可接受度更高[19]，HPV自取样或许可作为宫颈癌初筛手段[20]，且应用基于PCR 的HPV检测方法进行自取样标本可获得与医生取材一样的敏感性[21-22]，因此有学者认为Cobas HPV检测技术也可用于HPV自取样。
　　目前在中国广泛使用的HPV基因分型检测结合PCR技术、导流杂交及基因芯片技术为一体，可同时检测21种HPV基因型别，包括13种常见的高危型HPV、5种低危型HPV（6、 11、42、 43、 44、81型）和中国人常见基因型（HPV53、66、81型），并具体分型，判断多重感染[23]。
　　今年美國FDA批准的BD Onclarity HPV 检测系统，同样基于PCR技术。大多数HPV检测方法针对的是HPV基因组L1区，而该方法针对E6/E7 DNA 癌基因，其中样品处理、核酸提取、即时PCR扩增、检测以及结果报告均为自动化处理，同样可检测14种高危型HPV，但其报告为：6种高危型HPV（16、18、31、45、51和52型）为独立结果和其余8种高危型HPV另分为三个独立报告：（33、58型）、（35、39、68型）和（56、59、66型），可降低人为干预，大幅度提高实验室的工作效率。
　　2  HPV mRNA检测
　　该方法利用转录介导等温扩张技术，提取HPV E6/E7mRNA，在逆转录酶的作用下将mRNA进行逆转录扩增，分别对16型、18/45型和其他11种高危型HPV进行检测。研究数据显示该方法既具备HPV DNA的敏感性，又有与细胞学检查相似的特异性[24]，能较好平衡HPV检测的敏感性和特异性，同时可降低传统HPV DNA检测对于一过性HPV感染的检出率。E6/E7为HPV的致癌基因，在大量HPV持续被转录为E6/E7 mRNA ，表达大量癌蛋白时，可增加细胞恶变的风险[25-26]，因此较HPV DNA检测，HPV mRNA检测或许更能发现具有临床意义的HPV感染[27]，真正识别高风险的宫颈癌前病变人群[28]。Aptima HPV检测即为一种HPV mRNA检测，包括Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45 Genotype，后者可对前者阳性结果进一步分型，两者均在2011年获得美国FDA批准。但该方法同样缺乏内质控，不能具体分型，也可能与低危型HPV有交叉感染。
　　3  结语
　　宫颈癌筛查的目的在于尽可能识别出真正的癌前病变，避免对HPV一过性感染的过度检查及过渡治疗。HPV检测作为作为宫颈癌的重要筛查手段，基于HPV检测的优势，在发展中国家，尤其是经济欠发达地区可能有更高的应用前景，若合理利用，将对全球的宫颈癌防控产生重大意义。
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