辅酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用

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　　[摘要]目的 研究輔酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用。方法 采用乙醇注入法制备辅酶Q10脂质体。然后进行动物实验，将32只SPF级小鼠随机分成正常（CON）组、模型（MOL）组、辅酶Q10脂质体（COQ）组、二氧化钛（TiO2）组，每组各8只。CON组小鼠脱毛后不作任何处理，其余组小鼠脱毛后每天涂抹相应霜剂并进行紫外线照射，其中MOL组涂抹空白霜剂，COQ组涂抹辅酶Q10脂质体，TiO2组涂抹TiO2霜剂，照射剂量为最小红斑量，实验持续8周，结束后进行小鼠皮肤病理学观察与丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、基质金属蛋白酶（MMP-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量测定。结果 辅酶Q10脂质体最优处方为温度60°C、水相pH 7.7、辅酶Q10百分比0.9%、卵磷脂百分比1.6%，其包封率为44.7%，且脂质体大小均匀，成球状。MOL组小鼠皮肤组织的MDA含量与MMP-1相对表达量均高于CON组，SOD含量低于CON组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的SOD含量高于MOL组，MMP-1相对表达量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织的MDA含量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的GSH-Px含量高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 制备的辅酶Q10脂质体大小均匀，且具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用。
　　[关键词]辅酶Q10;脂质体;紫外线损伤
　　[中图分类号] R965          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）3（c）-0004-05
　　Preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect
　　WU Hai-you1，2   WU Yi2   WU Tie2，3
　　1. Dongguan Food and Drug Inspection Institute， Guangdong Province， Dongguan   523808， China; 2. Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang   524023， China; 3. Coenzyme Q10 Joint Research Center， Guangdong Medical University-Guangdong Runhe Biotechnology Co.， Ltd.， Guangdong Province， Dongguan   523808， China
　　[Abstract] Objective To study the preparation of coenzyme Q10 liposome and its anti-ultraviolet damage effect. Methods The coenzyme Q10 liposomes were prepared by injecting ethanol， then animal experiments were performed. A total of 32 SPF mice were randomly divided into normal （CON） group， model （MOL） group， coenzyme Q10 liposome （COQ） group， and titanium dioxide （TiO2） group， 8 mice in each group. The mice in the CON group were not subjected to any treatment after depilation， and the remaining groups of mice were smeared with the corresponding cream and irradiated with ultraviolet rays every day after depilation. Among them， the MOL group was smeared with the blank cream， the COQ group was smeared with the coenzyme Q10 liposome， and the TiO2 group was smeared with the TiO2 cream. The irradiation dose was the minimum amount of erythema， and the experiment lasted 8 weeks. After the end of the experiment， the skin pathology and the contents of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and matrix metalloproteinase （MMP-1）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in the mice were determined. Results The optimum formulation of coenzyme Q10 liposome showed as the temperature was 60°C， the water phase of pH was 7.7 and other was 0.9% of coenzyme Q10 and 1.6% of lecithin. The encapsulation efficiency of coenzyme Q10 liposome was 44.7%， and the liposome was uniform in size and globular. The MDA content and the relative expression of MMP-1 in skin tissue of the mice in the MOL group were higher than those in the CON group， and the SOD content was lower than that in the CON group， with statistically significant differences （P<0.05）. The SOD content in the skin tissue of the mice in the COQ group was higher than that in the MOL group， and the relative expression of MMP-1 was lower than that in the MOL group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MDA content in the skin tissue of the mice in the TiO2 group was lower than that in the MOL group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The GSH-Px content in the skin tissue of mice in the COQ group was higher than that in other groups， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion The prepared coenzyme Q10 liposome is uniform in size and has anti-ultraviolet damage effect on mice skin. 　　[Key words] Coenzyme Q10; Liposome; Ultraviolet damage
　　辅酶Q10俗称泛醌，是机体能量ATP供应的重要有机酶[1]。随着对辅酶Q10的不断研究，发现其在众多领域中均有药用价值，其中在皮肤老化保护方面，辅酶Q10含量可以作为衡量皮肤健康与否的重要指标[2-3]。本研究前期发现三种含辅酶Q10的防晒霜具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用，这是由防晒剂与辅酶Q10联合作用的结果[4]。那单独使用辅酶Q10能否达到抗皮肤紫外线效果呢？辅酶Q10作为一种大分子物质，分子量为863.36，而皮肤作为人体的第一道防线，辅酶Q10要直接透过表皮层比较困难[5-6]。所以借用脂质体载体，将辅酶Q10包裹，根据脂溶性物质相似相容性原理，脂质体透过表皮层发挥辅酶Q10的作用。目前已有文献报道运用脂质体载体可以将药物“运输”进真皮层发挥抗皮肤光损伤的作用[7]。本研究旨在研究辅酶Q10脂质体的制备及其抗紫外线损伤的作用，现报道如下。
　　1材料与方法
　　1.1试剂与仪器
　　1.1.1试剂  辅酶Q10（批号：2017052405）由广东润和生物科技有限公司提供;60%大豆卵磷脂（PC60，批号：20160410）购于海爱康精细化工;胆固醇、聚山梨酯80、无水乙醇、盐酸、PBS购于国药试剂;丙二醛（MDA）测试盒（批号：201802640）、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号：201712880）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（批号：201812041）、伊红-苏木精（HE）染色试剂盒（批号：201803930）购于南京建成公司;RT-qPCR反逆转录试剂盒（批号：201705467）与SYBR荧光染料购于TaKaRa公司。
　　1.1.2仪器  PCR扩增仪（Thermo公司）;UVB紫外灯及ST-513型紫外线辐照计（台湾先驰光电公司）;电子天平（上海民桥）;雷磁实验室pH计（上海精密仪器公司）;200 kV场发射透射电子显微镜（Tecani G2 F20 S-TWIN型）;酶标仪（中国普朗公司）;微量移液器（美国Thermo公司）、冷冻离心机（德国eppendorf公司）。
　　1.2辅酶Q10脂质体的制备
　　首先按一定比例精确称取辅酶Q10、PC60、胆固醇、聚山梨酯80、无水乙醇，55°C水浴搅拌20 min至完全溶解得到油相;再配制PBS溶液，作为水相，并于55°C恒温磁力低速搅拌，待油相搅拌完成后，用注射器将油相快速注射入水相中，并将水相搅拌速度提升至1000 r/mim、温度不变搅拌20 min，搅拌完成后即用显微镜观察是否有脂质体生成，将得到的脂质体溶液自然冷却到室温，保存在合适条件下[8]。
　　1.3包封率（encapsulation efficiency，EE）计算
　　 标准溶液的配制：准确称取辅酶Q10标准品10.00 g，溶解于无水乙醇中，并置于50 ml容量瓶中定溶，计算标准品溶液在300 nm波长处的吸光度值，多次测量求出平均值;样品处理：把制得的样品在4℃ 8000 r/min离心30 min，再取少量上清液用微孔滤膜过滤，这使得滤液中不含脂质体，用无水乙醇稀释滤液，最后在300 nm波长处测量稀释液的吸光度值，根据标准品吸光度值计算EE。
　　1.4正交处方优化
　　 以EE为考察标准，以制备温度（A）、水相pH值（B）、辅酶Q10百分比（C）、PC60百分比（D）4个因素作为考察因素进行正交处方优化，每个因素设置3个水平，按L9（34）正交表进行正交实验设计（表1）。
　　1.5实验动物造模
　　32只SPF级3月龄雌性KM小鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，体重（27.41±0.57）g，动物合格证：SCXK（粤）2011-0015，各小鼠均自由饮食。实验开始前，将小鼠背部皮肤进行物理脱毛，面积约为2×3 cm2，再随机分成四组，即正常（CON）组、模型（MOL）组、辅酶Q10脂质体（COQ）组、二氧化钛（TiO2）组，每组各8只。正常组小鼠脱毛后不作任何处理，其余组小鼠脱毛后每天涂抹相应霜剂并进行紫外线照射，其中MOL组小鼠涂抹空白霜剂，COQ组小鼠涂抹辅酶Q10脂质体，TiO2组小鼠涂抹TiO2霜剂，照射剂量为最小红斑量[9]，连持8周[10-11]，每周称量体重1次，实验结束后小鼠眼球取血处死，剪下皮肤进行指标检测。
　　1.6小鼠皮肤组织MDA、SOD、GSH-Px的测量
　　实验结束后，剪取3 g左右皮肤组织放进匀浆管中加入适量生理盐水进行冷冻匀浆，待组织块充分匀浆后4℃ 12 000 r/min 离心15 min，取离心管上层液，参照试剂盒提供的检测方法对小鼠皮肤MDA、SOD、GSH-Px进行检测，并计算其含量。
　　1.7小鼠皮肤病理学切片染色
　　实验结束后，剪下小鼠背部脱毛部位皮肤进行多聚甲醛固定、石蜡包埋，再进行HE染色，染色方法详细参照染色试剂盒说明书。
　　1.8小鼠皮肤组织基质金属蛋白酶（MMP-1）表达水平的检测
　　实验结束后，剪取3 g皮肤组织用Trizol进行匀浆，提取组织RNA，再参照RT-qPCR反逆转录试剂盒方法进行RNA转录，最后在SYBR荧光颜料的作用下PCR扩增仪进行基因相对表达量检测[12]。
　　1.9统计学方法
　　采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1脂质体制备方法的优选
　　初步确定制备工艺为温度、辅酶Q10投药量、大豆卵磷脂投入比例、水相pH为制备主干扰因素，设计一种四因素三水平正交实验进行处方优化，具体实验结果见表2，在温度的3个水平中（50、55、60°C）经试验发现60°C时效果较理;在pH的3个水平中（7.7、7.9、8.1）经试验发现pH为7.7时效果较理想;在辅酶Q10百分比的3个水平中（0.7、0.8、0.9%）经试验发现0.9%时效果较理想;在PC60百分比的3个水平中（1.3、1.6、1.9%）经试验发现1.6%时效果较理想。最优处方：温度为60°C、水相pH为7.7、辅酶Q10质量百分比為0.9%、PC60质量百分比为1.6%。 　　2.2脂质体电镜观察图
　　辅酶Q10脂质体在电镜下拍摄如图1所示，在电镜下脂质体清晰可见，大小分布均匀，成球状。
　　2.3各组小鼠每周体重的变化
　　实验期间各组小鼠体重变化如图2（封三）所示，CON、MOL组大鼠体重呈现先降低后增高的趋势，最后处于稳定状态，COQ、TiO2组大鼠体重则呈现一直增长，最后处于稳定的趋势。
　　2.4各组小鼠皮肤组织MDA、SOD、GSH-Px含量的比较
　　MOL组小鼠皮肤组织的MDA含量高于CON组，SOD含量低于CON组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的SOD含量高于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织MDA的含量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织的SOD含量低于COQ组，差异有统计学意义（P<0.05）;MOL组小鼠皮肤组织的GSH-Px含量低于CON组，COQ组小鼠皮肤组织的GSH-Px含量高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。
　　2.5各组小鼠皮肤组织病理切片染色的结果
　　各组小鼠皮肤组织病理切片染色如图3（封三）所示，CON组小鼠表皮层完整，厚度均匀;MOL组小鼠表皮层脱落严重，厚度较厚;COQ组小鼠表皮层完整，厚度较薄;TiO2组小鼠表皮层稍微脱落，厚度大小均一。
　　2.6各组小鼠皮肤组织MMP-1相对表达量的比较
　　MOL组小鼠皮肤组织的MMP-1相对表达量高于CON组，差异有统计学意义（P<0.05）;COQ组小鼠皮肤组织的MMP-1相对表达量低于MOL组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织的MMP-1相对表达量高于CON组，差异有统计学意义（P<0.05）;TiO2组小鼠皮肤组织的MMP-1相对表达量高于COQ组，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。
　　3讨论
　　辅酶Q10是一种泛醌，其分子量达到863.36，单独穿透皮肤表皮层的难度较大，所以本研究采用脂质体作为运输载体。脂质体是由卵磷脂和神经酰胺等制得的空心体，具有的双分子层结构与皮肤细胞膜结构相同，是一种很好的穿透皮肤运输载体[13-14]。但脂质体的制备受到多种因素干扰，其中包括：投药量百分比、水相pH值、卵磷脂百分比、温度等[15]，想要选择一种EE适合的处方需要经过一定的摸索探讨，本实验采用了四因素三水平的正交实验以获得最佳处方。当温度从低温往高温变化时，辅酶Q10 EE出现波动性变化，但考虑投入与效率等方面的因素，这里选择60°C为最佳温度。在水相pH三个因素下，当其从低往高变化时，辅酶Q10平均EE逐渐降低，所以选择7.7为最佳水相pH。辅酶Q10的投药量则跟水相pH呈现相反特点，当其从低往高变化时，辅酶Q10平均EE逐渐减升高，所以选择投药量百分比为0.9%。最后，PC60投入量百分比在1.6%与1.9%时，辅酶Q10 EE较理想，但考虑投入与效率等方面的因素，这里选择投入量百分比1.6%。所以经正交实验表获得最佳处方：温度为60°C、水相pH 7.7、辅酶Q10百分比为0.9%、PC60百分比为1.6%。根据该处方制备的辅酶Q10脂质体大小分布均匀，成球状，是一种较理想的辅酶Q10剂型。
　　辅酶Q10脂质体是一种油相包裹辅酶Q10的制剂，可以快速地将辅酶Q10“运输”进皮肤。然而关于脂质体是如何将辅酶Q10“运输”进皮肤的作用机制目前尚未清楚，目前认为辅酶Q10脂质体可能通过以下几种机制进入皮肤：水合机制、融合机制、穿透机制。水合机制认为脂质体可能通過增加角质层湿化和水合作用，改变角质细胞间结构，促使药物通过扩散等作用进入细胞间质[16]。融合机制认为脂质体的主要成份磷脂科与表皮脂质层融合，改变其组成，形成一种扁平的颗粒状结构，使其屏障作用发生逆转，载药脂质体则可顺利通过表皮[17]。穿透机制认为由于皮肤表面和内部存在的水浓度差异能为脂类载体穿透皮肤提供动力来源，这就使得脂质体能顺利穿脱皮肤。在本实验中，当辅酶Q10脂质体能顺利透过皮肤，发会辅酶Q10的抗紫外线损伤作用。皮肤组织生化指标结果显示，辅酶Q10脂质体小鼠皮肤组织MDA含量明显降低，SOD与谷胱甘肽活力明显升高，而TiO2组小鼠皮肤组织的SOD与谷胱甘肽活力均低于COQ组（P<0.05），提示辅酶Q10能有效发挥抗紫外线作用，其作用效果比TiO2优。辅酶Q10作为一种抗氧化剂，其可以清除皮肤组织自由基及抑制其产生的一系列连锁反应。另外从皮肤病理切片与MMP-1表达量角度来看，辅酶Q10具有抗紫外线损伤作用。MMP-1及其相关通路在皮肤光老化中起重要作用，MMP-1能特异性降解几乎所有细胞外基质成分，造成正常胶原成分和弹性纤维降解，导致皮肤光老化[18]，而有研究报道人真皮成纤维细胞在紫外线照射后主要产生MMP-1、MMP-3和MMP-9，并认为它们在光老化的过程中起很大的作用[19-20]。COQ组小鼠MMP-1皮肤组织MMP-1相对表达量比MOL、TiO2组低（P<0.05），提示辅酶Q10具有抗紫外线损伤作用，并且其作用比TiO2优。
　　综上所述，正交实验筛选出最优处方：温度为60℃、水相pH为7.7、辅酶Q10百分比为0.9%、PC60百分比为1.6%，辅酶Q10脂质体能顺利通过皮肤角质层发挥抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用，且效果比TiO2优。
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　　（收稿日期：2019-08-08  本文编辑：任秀兰）
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