应用溶剂注入法制备抗耐药结核菌药物利奈唑胺脂质体的实验研究

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　　[摘要] 目的 利用乙醇注入法制备利奈唑胺脂质体，并通过响应面法优化处方及工艺。 方法 单因素考察优选出主要影响因素并联合Box-Behnken响应面法分析筛选出最佳处方及工艺，并以此工艺制备载药脂质体。使用倒置荧光显微镜对最佳工艺条件下制备的利奈唑胺脂质体进行形貌观察。 结果 最佳工艺为：胆固醇与卵磷脂的质量比1：3、类脂注入缓冲液速度1.2 mL/min、超声时间3 min。包封率82.36%，RSD=1.32%，显微镜观察利奈唑胺脂质体粒径较均一，形态圆整。 结论 乙醇注入法制备利奈唑胺脂质体具有较高的包封率，Box-Behnken响应面法可快速全面选取最佳制备工艺，方便准确。
　　[关键词] 耐药结核菌;利奈唑胺脂质体;乙醇注入法;响应面法;包封率
　　[中图分类号] R944          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）04-0033-04
　　Experimental study on preparation of linezolid liposomes against drug-resistant tuberculosis by solvent-injection method
　　LIU Jinli1   TONG Lei2   YU Chunyan1   LIU Junhong1   WANG Liying1
　　1.Department of infection， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang   157011， China; 2.School of Pharmacy， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang   157011， China
　　[Abstract] Objective To prepare linezolid liposome using ethanol injection method and optimize its prescription and preparation using the response surface method. Methods Single-factor experiment was used to select main influencing factors， and Box-Behnken response surface analysis was combined to find the optimal prescription and preparation. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results Under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：3， the velocity of lipoid buffer injection was 1.2 mL/min， and the ultrasonic time was 3 min; the entrapment rate was 82.36%， RSD=1.32%. Under microscopic observation， the particle diameter of linezolid liposome was uniform， and the morphology was round. Conclusion The entrapment rate of linezolid liposome prepared by the ethanol injection method is relatively high， and the Box-Behnken response surface method can quickly and comprehensively select the optimal preparation process， which is convenient and accurate.
　　[Key words] Drug-resistant tuberculosis; Linezolid liposome; Ethanol injection method; Response surface method; Entrapment rate
　　肺結核病是一种慢性的由结核分枝杆菌感染引起的传染病，由于结核杆菌寄生于肺泡深处，导致很多情况下用药效果不好。近年来，利奈唑胺（linezolid）因其较好的抗菌活性而备受关注，目前利奈唑胺剂型多为口服片剂或注射剂，虽然其具有一定效果，但由于口服或注射后药物分布全身，进入肺部药量有限，加之利奈唑胺有较多的不良反应，如胃肠道反应（腹痛、呕吐等）、头痛和皮疹等，使其用药受限，脂质体是抗结核药物的理想载体，而且脂质体的结构与细胞膜相似，可有效实现药物传递，因此将利奈唑胺制备成脂质体直接肺部给药可使药物直接作用于病变部位，减少药物在体内其他组织的分布，增加靶区血药浓度，延长药物肺内滞留时间，降低毒副作用。本实验采用溶剂注入法将利奈唑胺制备成载药脂质体，并考察其最佳制备工艺和处方组成，为其进行肺部直接给药研究奠定基础[1-8]，现报道如下。 　　1 资料与方法
　　1.1 仪器和材料
　　紫外分光光度计（UV-6000PC），郑州宝京科技有限公司;复合转子离心机（Mnty-7KS），北京佑宁仪器有限公司;医用无菌注射器（7号），苏州治宇医疗器材有限公司;数控探头超声（SCQ-5211B），常州市超声仪器有限公司;磁力搅拌加热板（MSH-R-B），上海越众仪器有限公司;LS13320型激光粒度分析仪，江苏荣华仪器制造有限公司;倒置荧光显微镜（U-LH 100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陕西澄明科技有限公司;胆固醇（20180228），江苏百得科技有限公司;二氯甲烷（20180315），济南奥康化工股份有限公司。
　　1.2 方法
　　溶劑（乙醇）注入法制备利奈唑胺脂质体。精密称取处方考察量卵磷脂和胆固醇、10 mg利奈唑胺原料药于烧杯中，加入95%乙醇5 mL，吐温80 0.2 mL，在60℃恒温水浴下搅拌至充分溶解形成类脂，同时量取pH=6.7的缓冲液（PBS）40 mL置于恒温50℃水浴磁力搅拌器上预热，用10 mL注射器抽取上述类脂溶液在考察量范围内注入至50℃PBS溶液中，搅拌水化1 h，室温下旋转蒸发除去乙醇，取出样品在考察范围内进行探头超声，超声后置于40℃恒温水浴锅中放置0.5 h，即得成品[9]。
　　2 结果
　　2.1 利奈唑胺脂质体含量测定
　　2.1.1 检测波长确定及专属性考察  采用紫外分光光度法测定含量。利奈唑胺适量定容后得到浓度为20 μg/mL的利奈唑胺溶液，另取卵磷脂和胆固醇适量制备空白脂质体，分别于200～400 nm的波长范围内用紫外分光光度计每相隔10 nm测定吸光度，进行曲线绘制，探索最大吸收波长。利奈唑胺最大吸收波长289 nm，而空白脂质体在289 nm处无最大吸收，对于利奈唑胺的吸光度测定基本无干扰，表明专属性良好。
　　2.1.2 含量测定方法学考察  称取1 mg利奈唑胺，定容至25 mL，得到浓度为40 μg/mL的备用液。分别稀配后得到对应浓度为1、2、4、8、12、16、20、24 μg/mL的线性关系工作溶液。以pH=6.7的PBS溶液为空白对照，在最大吸收波长处测定吸光度。以利奈唑胺浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标建立标准曲线并进行线性分析，得到标准曲线A=0.01C+0.0516，R2=0.9998。线性范围为1～24 μg/mL，以此为依据考察其精密度、重复性、回收率、稳定性RSD值均符合要求。
　　2.1.3 利奈唑胺脂质体包封率测定方法确立  本实验采用超速离心法分离游离药物和载药脂质体，精密量取等质量的利奈唑胺脂质体，室温下以16 000 r/min高速离心30 min，取上清液0.2 mL至25 mL容量瓶中定容，测定吸光度，代入方程即得C游离;再取等质量利奈唑胺脂质体，甲醇破乳后，充分振荡离心后计算C总。包封率=（C总-C游离）/C总×100%，其中：C游离是上清液中游离药物浓度;C总是破乳后利奈唑胺脂质体的药物浓度[10-11]。
　　2.2 单因素考察
　　2.2.1 胆固醇与卵磷脂质量比考察  称取利奈唑胺10 mg，固定脂质溶液注射速度2.4 mL/min，探头超声时间3 min，水浴温度50℃按照1.2项方法制备脂质体，分别考察不同胆固醇与卵磷脂用量比[100：200、100：300、100：400、100：500（mg：mg）]所得包封率，并对其进行统计学分析，结果显示不同胆卵比下其包封率分别为76.77%、80.21%、77.31%、77.09%，分析其包封率差异有统计学意义，且在胆卵比为100：300时，包封率最大，故以胆卵比1：3为中心进行进一步优化[12-14]。
　　2.2.2 水浴温度的考察  称取利奈唑胺10 mg，固定胆卵比100：300（mg：mg），脂质溶液注入速度4.8 mL/min，探头超声时间5 min，按照1.2项下方法制备脂质体，分别考察不同水浴温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）所得包封率，其结果分别为73.3%、73.29%、73.31%、73.34%、73.3%，差异无统计学意义，故不将温度作为进一步优化的考察条件。
　　2.2.3 探头超声时间考察  称取利奈唑胺10 mg，固定胆卵比100：300（mg：mg），脂质溶液注入速度1.2 mL/min，水浴温度50℃，按照1.2项下方法制备脂质体，分别考察不同超声时间（1、3、5、7 min）所得包封率，其结果分别为75.31%、79.18%、75.29%、74.89%，分析其差异有统计学意义，且在超声时间为3min时包封率最大，故以超声时间3 min为中心进行进一步优化。
　　2.2.4 脂质溶液注入PBS溶液注入速度考察  称取利奈唑胺10 mg，固定胆卵比100：300（mg：mg），探头超声时间3 min，水浴温度50℃，按照1.2项下方法制备脂质体，分别考察脂质溶液注入PBS溶液的不同注入速度（0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 mL/min）所得包封率，其结果分别为76.37%、77.89%、80.66%、75.33%、72.21%。差异有统计学意义，且在注入速度为1.2 mL/min时包封率最大。故以注入速度1.2 mL/min为中心进行进一步优化。
　　2.3 Box-Behnken响应面法优化工艺
　　根据单因素考察结果，采用Box-Behnken响应面优化工艺，选取上述四种单因素中对包封率影响较明显且制备所得脂质体包封率最高的三个因素，进行3因素3水平试验，方案设计如表1所示，以包封率为其响应值[15]。 　　2.3.1 响应面试验与结果  通过单因素考察后确定对脂质体包封率影响较大且包封率为最大值时的三个主要因素，根据Box-Behnken试验设计原理，采用响应面法优化设计，见表2。对试验结果进行响应面曲面分析，建立二元多次回归方程进行回归分析，见表3。
　　2.3.2 方程拟合  采用Design Expert 8.0.8对数据进行回归分析，得到回归方程如下：Y=91.17+1.19A+0.45B+1.14AB-0.21AC-0.55BC-9.40A2-7.24B2-7.60C2，由表3可知，本实验模型具有高度显著性（P<0.0001），失拟度P=0.0835>0.05为不显著的，表明该模型无失拟因素而且模型中主要考察因素P值均小于0.05，模型决定系数R2=0.9950，R2Adj=0.9886，代表本次试验的预测值与真实值相差极小，综上所述，表明該模型拟合度良好。
　　2.3.3 响应曲面分析  封三图4、封三图6、封三图8为胆卵比与超声时间、注入速度与超声时间、超声时间与胆卵比三组因素对脂质体包封率的响应面图，封三图5、封三图7、封三图9中三组等高线为类椭圆形，等高线与轴线的相交点较多表明被考察因素对脂质体包封率的影响均较大，最终得出最佳处方工艺为胆卵比1：3、注入速度1.23 mL/min、超声时间3.07 min，根据操作可行性，确定工艺为胆卵比1：3、注入速度1.2 mL/min、超声时间3 min。
　　2.4 试验结果验证
　　按照最佳工艺方法制备脂质体并进行包封率测定，得到三批脂质体的平均包封率为82.36%，RSD为1.32%，表明该方法制备的脂质体质量稳定。
　　2.5 最佳工艺下所制脂质体外观形态观察及平均粒径检测
　　本实验以最佳工艺制得的载药脂质体混悬液如封三图10所示，混悬液呈乳白色，普通光源下通过倒置荧光显微镜观察，可以看出所制备的载药脂质体数目较多且形貌较为圆整如封三图11，激光粒度仪检测平均粒径在489 nm左右。
　　3 讨论
　　在制备脂质体时影响脂质体制备工艺的因素有很多，若进行单因素实验，不能进行因素与因素之间的相互影响考察，响应面法既反映了单一自变量与包封率之间的关系，又体现出每个自变量相互间的作用对包封率的影响，使最佳的考察因素不仅仅局限于设计试验所选择的几个点，而是存在于一个由连续的点构成的曲面的极值处，并且仅为一个点。因此采用响应面法进行工艺优化比常规的正交试验设计考察方法更为优化。本实验所制得脂质体粒径在500 nm左右，粒径较大，但对于肺部直接给药，其更有利于肺部对载药脂质体的机械性滤阻，增加肺部的药物摄取量，延长药物在肺内的滞留时间，增加药物与结核菌的作用时间。由于实验条件和时间有限，在接下来的实验中欲采用体外释放度试验初步考察载药脂质体的缓释性能，采用肺部滴注的给药方式对其进行肺部直接给药，并进一步考察将利奈唑胺制备成脂质体后在体内的分布情况及药物动力学情况。
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　　（收稿日期：2019-09-10）
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