在体微透析观察大鼠急性一氧化碳中毒后纹状体多巴胺及其代谢产物的变化

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　　摘要： ［目的］ 研究急性一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒对大鼠脑纹状体多巴胺（DA）及其代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）水平的影响。 ［方法］ 将大鼠随机分成对照组和CO中毒组，采用腹腔注射CO法染毒，首次染毒剂量为120 ml/kg，然后每隔4 h注射一次，共3次维持剂量60 ml/kg，对照组以同样方法和剂量注射空气。观察首次染毒后24 h 内各组动物血碳氧血红蛋白（HbCO）浓度变化，同时利用在体微透析技术观察脑纹状体DA及其代谢产物在末次染毒后11 h内及第10 d的变化特点。 ［结果］ 腹腔注射CO染毒后，大鼠血HbCO浓度迅速增高，在首次染毒后1～2 h达高峰，维持剂量连续染毒时，血HbCO浓度可维持在55%以上达15 h，末次染毒6 h后降至正常水平；末次染毒后，大鼠脑纹状体DA水平增加，其代谢产物明显减少，至第4～6 h开始逐渐恢复，第11 h恢复到正常水平；末次染毒后第10天中毒组动物纹状体DA水平与对照组比较再次明显降低，其代谢产物水平明显升高。 ［结论］ CO中毒血HbCO浓度恢复正常水平后，提示DA及其代谢产物再次出现异常变化可能与急性CO中毒迟发性锥体外系神经精神症状有关。
　　关键词：一氧化碳；急性中毒；多巴胺；纹状体；锥体外系症状
　　
　　Characterization of Dopamine and Its Metabolites in the Striatum of Rats Due to Carbon Monoxide Poisoning as Determined by in vivo MicrodialysisGUAN Li，ZHAO Jin-yuan*，WEN Tao，ZHANG Yan-lin（Research Center of Occupational Medicine，The Third Hospital of Peking University，Beijing 100083，China）
　　Abstract：［Objective］ To explore the effect of Carbon monoxide（CO）poisoning on the changes of dopamine（DA）and its metabolites dihydroxyphenylacetic acid（DOPAC）and homovanillic acid（HVA）in the striatum of free-moving rats. ［Method］ Rats were divided at random into two groups，control group and CO intoxicated group. CO was injected into rats of the intoxicated group intraperitoneally at a dosage of 120 ml/kg for the first time，and then repeated injections with CO（60 ml/kg）for 3 times at 4 h intervals was provided.Same amount of air was injected into the control rats intraperitoneally at the same intervals.HbCO levels in the blood of rats was measured for 24 hours after the first CO administration，and changes of DA and its metabolites levels in the striatum was observed for 11 hours and at the 10th day after the last CO administration，as determined by means of brain microdialysis. ［Results］ Compared to control group，HbCO level increased much higher and reached the peak at 1 to 2 hours after the first CO administration，and it could be kept above 55% for 15 h. CO poisoning significantly changed extracellular DA and its metabolites level in the striatum and after 4-6 hours gradually recovered again. At the 10th day，DA level was remarkably decreased again，its metabolites increased. ［Conclusion］ When HbCO level returned to the normal level after the last CO administration，there were significantly changes again of DA and its metabolites. It suggested that these changes could be related to the extrapyramidal syndrome after CO poisoning.
　　Key Words：carbon monoxide；acute poisoning；dopamine；striatum；extrapyramidal syndrome
　　
　　一氧化碳（carbon monoxide，CO）是含碳物质未充分燃烧所产生的无色、无味的有毒气体。以碳为主要燃料的物质都可以成为人们日常生活中CO的来源。急性CO中毒对神经系统损害较为严重，急性中毒后不但可引起脑缺氧、脑缺血及脑水肿等，另外大概有2%～30%患者常在中毒后经过一段表现正常或者接近正常的“假愈期”，突然再次出现一组以痴呆为主，伴有锥体外系症状的神经精神损伤，称之为CO中毒“迟发性脑病”（delayed neuropsycholigic sequelae，DNS）［1-4］。该病病程长，治疗难，无特效防制手段，一直是医学界关注的焦点之一。
　　急性CO中毒迟发性脑病帕金森样症状是急性CO中毒迟发性脑病的常见临床表现，但其病理机制仍不明确［5，6］。脑多巴胺（DA）神经递质与机体的行为活动密切相关，本研究利用在体微透析技术观察了大鼠急性CO中毒后血HbCO和纹状体DA及其代谢产物的变化特点，以探讨纹状体DA及其代谢产物变化在急性CO中毒后的意义。
　　
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　实验动物SD大鼠，体重250～300 g，由北京大学医学部动物实验中心提供；CO纯品由北京兆格气体有限公司提供（体积分数99.95%）；HPLC-ED 由美国Agilent1100液相恒流泵、HP 1049电化学检测器、玻璃碳工作电极（以Ag/AgCl为参考电极）组成；柱为C18反相色谱柱（ODS，150 mm×4.6 mm，5 μm），标准品DA、二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HAV）均为Sigma产品；实验中所用其它试剂为进口或国产分析纯试剂。

　　1.2 实验方法
　　1.2.1 动物分组 大鼠随机分为对照组和CO中毒组，每组10只。参照王耀宏等人建立的方法［7］制备CO急性中毒迟发性脑病模型，CO中毒组首次经腹腔注射纯品CO气体，首次剂量120 ml/kg，然后每隔4 h追加注射一次，共作3次维持剂量为60 ml/kg的注射，对照组按同样方法和剂量注射空气。
　　1.2.2 血HbCO浓度测定 采用改良的双波长HbCO定量法测定［8］大鼠血HbCO的浓度，包括首次染毒后24 h内连续26次监测，及染毒后第10天大鼠血HbCO浓度监测。取大鼠尾静脉血0.1 ml，加0.4 mol/L氢氧化铵20 ml，混匀加20 mg低压硫酸钠再混匀；10 min内于535 nm及575 nm波长下测定光密度（D535，D575），按照下列公式计算 HbCO含量：HbCO（%）=［（2.44×D535/D575）-2.68］×100%。
　　1.2.3 在体微透析实验方法 麻醉SD大鼠（戊巴比妥钠400 mg/kg，ip.），将头部脱毛的大鼠固定在立体定位仪上，暴露头骨，确定前卤位置，并将CMA/12探针套管对准此点，按立体定位仪座标：AP 0.6 mm，ML 2.5 mm，DV 7 mm［9］值定位，使CMA/12探针套管缓慢降至所需深度。用外科水泥固定套管，手术后局部用青霉素抗感染，18～24 h后进行微透析实验。透析时拔除套管，进入探针，探针进口管连接CMA/100微透析泵，以1.5 μl/min速度灌流，灌流液成分：NaCl 147.0 mmol/L，KCl 4.0 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，CaCl2 2.20 mmol/L，Na2HPO4 0.45 mmol/L，pH 7.4，出口管连接HoneyCombTM低温收集器，每30 min收集1管样品，加入5 μl抗氧化剂（高氯酸溶液0.4 mol/L）后立即用高效液相色谱仪检测。
　　1.3 统计方法
　　采用SPSS 11.0软件进行统计分析，实验组与对照组检测结果比较用配对t检验和单因素方差分析。
　　
　　2 实验结果
　　2.1 染毒后血HbCO浓度变化（图1）
　　CO中毒组于首次腹腔注射后15 min血HbCO浓度明显升高，1～2 h达高峰，4～6 h后呈现衰减趋势，间隔注射CO后，血HbCO浓度可维持在55 %以上达15 h；对照组血HbCO浓度在监测时间内保持在2%～5%。
　　
　　2.2 染毒后11 h内脑纹状体DA及其代谢产物水平（图2）
　　与对照组比较，末次CO染毒后，CO中毒组纹状体DA水平升高，其代谢产物DOPAC、HVA等水平均显著下降，见图2A，图2B，图2C。尤其在末次染毒后的4 h，纹状体DA水平较对照组升高约40%，代谢产物DOPAC降低约40%，HAV降低约35 %（P<0.01），见图2D。中毒后11 h DA及其代谢产物均逐渐恢复到染毒前水平。
　　2.3 染毒后第10天血HbCO浓度及纹状体DA及其代谢产物水平
　　染毒后第10天，CO中毒组血HbCO浓度与对照组比较无明显差异，纹状体DA水平再次明显降低，仅为对照组的77%（P < 0.05），其代谢产物DOPAC，HVA水平分别升高26 %和40 %（P < 0.05），见表1。
　　
　　4 讨论
　　各种原因导致的急性CO中毒是世界范围中毒性急救的主要疾病之一，而且约2%～30%的患者即使经过及时治疗，也可能再次出现以神经精神障碍为主，伴有锥体系及锥体外系功能障碍的CO中毒后迟发性脑病（DEACMP），严重影响患者的生活质量。目前认为DA在运动协调、行为情感、认知以及神经内分泌调节等正常生理活动中具有重要意义［10-12］，许多精神失调性疾病也与脑DA神经系统功能障碍密切相关［13，14］。
　　本研究利用在体微透析技术观察了末次CO染毒后11 h及第10天纹状体DA及其代谢产物水平的变化特点，结果显示间隔CO染毒后，血HbCO浓度迅速升高维持约15 h后逐渐恢复至正常水平，在血HbCO恢复期间纹状体DA水平呈先升高又降低的变化过程，其代谢产物水平则呈现显著降低又升高至正常水平的变化过程。上述结果提示急性CO中毒后胞质DA代谢率明显降低，有研究证实大量外源性CO能刺激Na+依赖性DA释放同时又抑制DA降解代谢，可导致纹状体细胞外液DA水平升高［15］；正常大气压下CO中毒后高浓度HbCO可迅速解离，脑组织恢复氧气供应，此过程中能激活单胺氧化酶A（MAO-A），增加DA代谢，实验中观察到伴随血HbCO浓度由高水平恢复正常，纹状体DA的代谢水平呈先抑后扬的变化现象可能与上述原因有关。
　　我们以往的研究发现［7］，采用间隔腹腔注射CO法染毒大鼠后，早期主要为神经元变性和组织水肿为主的脑组织缺氧性损伤，在中毒后7～14 d可出现明显的迟发性脑损伤改变，在迟发性病变多发期（CO染毒后10 d）观察发现纹状体细胞外液DA水平显著升高，代谢产物水平降低的显著变化。从代谢角度看，DA是MAO的主要底物，MAO在DA代谢途径中发挥重要作用；临床研究报道，老年人神经组织MAO水平明显升高；阿尔采默茨病（AD）患者前额皮质MAO-B活性比正常者升高16 %，且脑内MAO-A和MAO-B的mRNA水平显著升高。袁野等人［16］在连续7 d用CO染毒小鼠后发现，与铝中毒模型和脑缺血再灌注模型比较，MAO-B活性显著升高，并提出CO中毒可导致MAO-B活性显著升高，其病变可能累及包括锥体外系在内的区域如黑质和纹状体。
　　上述DA在CO中毒后的变化是否与急性CO中毒后脑损伤和神经功能改变有相关性也是值得研究的问题之一。CLEMENS等人［17］证实DA在神经元缺血性坏死中有重要作用，他们用6-羟基多巴胺耗竭一侧纹状体的DA，然后使全脑暂时缺血，发现DA耗竭侧纹状体神经元无坏死现象，对侧纹状体神经元出现大量坏死，说明DA在缺血性神经元死亡中有重要意义。目前研究认为急性CO中毒后尤其在迟发性脑病多发期存在脑循环障碍［18］，可能是导致纹状体DA水平在CO中毒后出现二次变化的原因之一。

　　本研究在建立急性CO中毒模型基础上，用在体微透析方法动态观察了急性CO中毒后11 h内纹状体细胞外液DA及其代谢产物的变化，又在前期研究的基础上，选择急性CO中毒出现迟发性病变的多发期与对照组比较观察了纹状体细胞外液DA及其代谢产物的变化特点。上述时间点纹状体DA及其代谢产物水平变化的根本原因，以及该变化是否参与急性CO中毒后迟发性神经功能损害值得深入研究，从临床防治急性CO中毒角度看，是否能将急性CO中毒后监测脑脊液DA水平变化作为判断急性CO中毒预后及迟发性脑病的早期检测指标，对临床防治急性CO中毒迟发性脑病具有重大意义。
　　
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　　（收稿日期：2006-09-25）
　　（英文编辑：黄建权；校对：洪琪）
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