转基因何首乌毛状根的研究进展

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　　摘要    何首乌毛状根体系因为遗传稳定、生长迅速的特点，在次生代谢产物合成和提取方面具有优势。本文概述了何首乌毛状根体系的诱导和培养过程、影响何首乌毛状根生长及其次生代谢产物积累的因素，并就何首乌毛状根在生物转化以及次生代谢工程方面的应用前景进行了展望。
　　关键词   何首乌;毛状根;生物转化;次生代谢工程
　　中图分类号    R282.71        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）02-0054-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    Because of the characteristics of genetic stability and rapid growth，the hairy root system of Polygonum multiflorum has advantages in the synthesis and extraction of secondary metabolites.This paper summarized the induction and culture process of Polygonum multiflorum hairy roots，the factors affecting the growth of hairy roots and the accumulation of secondary metabolites and forecasted the application prospects of Polygonum multiflorum hairy roots in biotransformation and secondary metabolic engineering.
　　Key words    Polygonum multiflorum;hairy root;biotransformation;secondary metabolic engineering
　　何首烏是我国历代常用的传统中药材，含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、总糖及还原糖等重要化学成分，具有极大的药用价值[1]。二苯乙烯苷作为何首乌的主要药效成分，《中国药典（2015年版）》将其确定为何首乌原药材的质量控制指标[2]。但是，因其为次生代谢产物，直接在何首乌中提取的量极微，因而利用组织培养技术快速获取二苯乙烯苷等有效成分成为一种研究趋势。关于何首乌的组织培养，目前研究较多的为愈伤组织细胞培养以及毛状根培养，两者的培养体系目前均已相对成熟。但是由于二苯乙烯苷等有效成分主要在何首乌的块根及老藤中积累，而何首乌毛状根体系类似于何首乌的块根组织，所以在有效成分的积累方面，毛状根较之愈伤细胞具有优势。笔者多年来致力于何首乌二苯乙烯苷次生代谢途径的研究，结合课题组研究成果，概述了何首乌毛状根体系的诱导和培养过程、影响何首乌毛状根生长及其次生代谢产物积累的因素，并就何首乌毛状根在生物转化以及次生代谢工程方面的应用前景进行了展望。
　　1    何首乌毛状根的诱导及培养
　　早在1998年，何首乌毛状根培养被初次报道，施和平等[3]利用发根农杆菌R1601感染何首乌无菌叶片和叶柄，15 d后均能得到长势良好的毛状根。其后，何首乌毛状根被相继研究和利用。总体来讲，影响何首乌毛状根诱导及培养的因素主要有农杆菌菌种、菌体诱导方式、培养基等。
　　1.1    发根农杆菌菌株的选择
　　不同菌株对何首乌毛状根的诱导效果不同。目前研究报道，在何首乌毛状根的诱导中使用较多的发根农杆菌菌株有ATCC15834、Rl601、LBA9402等，这些菌株中均含有侵入性农杆碱型Ri致根质粒。王  莉等[4]利用发根农杆菌LBA9402和R1601诱导何首乌无菌外植体得到了快速稳定繁殖的何首乌毛状根。朱宽鹏等[5]利用发根农杆菌ATCC15834建立了稳定遗传的毛状根体系，并利用该体系进行了外源基因的超表达和RNA干扰，获得了较好的效果。虽然在其他药用植物毛状根诱导过程中也有发根农杆菌K599、A4等菌株的报道，但是在何首乌中其他菌株的应用还有待进一步研究。
　　1.2    发根农杆菌侵染植株的方法
　　发根农杆菌侵染植株的常用方法有直接注射法和接种感染法。直接注射法是用活化好的新鲜菌液对无菌幼苗进行2～3次注射，注射处往往在2周内会产生毛状根。接种感染法则是将何首乌无菌外植体切割后，放入已活化的发根农杆菌菌液共孵育，然后接种到培养基上进行共培养，一般2～4周后可以诱导出毛状根。如今多数研究均采用接种感染法转化何首乌外植体，因为王  莉等[4]研究发现，与直接感染法相比，接种感染法诱导率相对较高，但由于该法菌侵染的概率较大，后期可能会导致除菌困难。 　　1.3    培养基的选择
　　多项研究表明，MS培养基是目前最适合何首乌毛状根生长的培养基。邱立鹏[6]在试验中比较了MS、1/2MS、B5和White 4种不同培养基对毛状根生长的影响，结果表明，经过40 d的培养，毛状根在MS培养基的增长倍数最高;严春艳等[7] 也进行了类似试验，并绘制了生长曲线，也发现毛状根在MS培养基中的生长曲线高于其他3个，说明MS培养基最适合转基因何首乌毛状根的生长。MS培养基属于高盐浓度的培养基，含有较高浓度的NH4+、NO3-、PO43-、Ca2+等无机盐和离子，究其原因可能是何首乌毛状根生长比较旺盛，需要MS这样的高盐度培养基提供充足的营养。
　　2    影响毛状根生长及其次生代谢产物形成的因素
　　毛状根培养技术现已广泛应用于提高药用植物的有效药成分含量，通过控制不同的培养条件，添加相应的化学因子可以达到提高次生代谢产物的目的。目前，对于毛状根培养的影响因素，研究较多的有光照、pH值、温度等物理因素以及外源添加激素、诱导子等化学因子。由于目前对何首乌毛状根的培养影响因素没有系统全面的试验研究，本文结合其他药用植物在该领域的研究，指出可能影响何首乌毛状根生长及其次生代谢产物形成的因素。
　　2.1    物理因子
　　光照、温度、pH值以及培养基中的碳源和氮源等都会影响毛状根的生长及其次生代谢产物的合成，良好的毛状根体系往往是多个因素共同作用的结果。杨  睿等[8]研究了影响水母雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的理化因子，结果发现，合适的碳源和氮源浓度、添加一定的激素、24 ℃培养并给予一定的光强、pH值为5.8时最有利于毛状根的生长及总黄酮的生物合成;除了上述条件，摇床转速也会影响其生长和代谢。在何首乌的毛状根培养中，还未见对特定物理因素如光照、温度、pH值等的综合研究。潘瑞帜等[3]诱导何首乌毛状根采用的是光强2 000 lx、光照时间14 h/d，1个月后诱导得到何首乌毛状根;王  莉等[4]则是采用25 ℃暗培养40 d，对于光照如何影响何首乌毛状根的诱导和生长，甚至对其次生代谢产物的合成有没有影响，至今还未见报道，下一步研究可以对其进行深入探讨。
　　2.2    化学因子
　　2.2.1    外源激素。虽然毛状根在不添加外源激素的情况下也能快速生长，但其次生代谢产物的形成和积累离不开激素。不同的激素可以通过调节植物细胞中不同的酶体系影响次生代谢产物的形成[8]。因此，可以通过添加外源激素以及调节激素的浓度和比例，提高毛状根中目标活性成分的积累，从而有利于人们对药用植物活性成分的大量提取。于荣敏等[9]在试验中研究了3种常见的外源激素，结果发现，NAA、2，4-D会促进何首乌毛状根的生长，而6-BA则会抑制何首乌毛状根的生长及其次生代谢产物蒽醌类的积累。
　　2.2.2    诱导子。在培养基中添加的可以刺激毛状根产生次生代谢产物的化学或生物因子就是诱导子。酵母提取物、茉莉酸甲酯、水杨酸等多种物质常常被作为诱导子对药用植物毛状根中的活性成分进行刺激合成。张金家等[10]考察了酵母提取物、茉莉酸甲酯、水杨酸和银离子等诱导子对丹参毛状根及其中丹酚酸的影响，结果发现，4种诱导子对丹参毛状根的生长均无显著影响;茉莉酸甲酯和水杨酸能提高丹酚酸的含量，酵母提取物反而会降低丹酚酸，Ag+无显著影响。郭  双等[11]在研究诱导子对颠茄毛状根的影响时发现，AgNO3是提高颠茄毛状根中托品烷类生物碱含量的最佳诱导子，酵母提取物可以同时促进颠茄毛状根的生长及其次生代谢。关于何首乌诱导子的研究报道还不多见，严春艳等[7]发现，水杨酸、茉莉酮酸甲酯这2种诱导子会抑制何首乌毛状根的生长，但诱导子对其次生代谢产物的影响还未见报道。
　　3    何首乌毛状根的生物转化
　　生物体系中会存在各种各样的酶，而这些酶系统能够对外源性底物进行糖基化、羟基化、甲基化、氧化、还原等结构修饰，即为生物转化。由于多酶催化作用的不确定性，还可能产生一些新的活性物质。朱建华等[12]研究发现，转基因何首乌毛状根可以将青蒿酸转化为3个青蒿素类化合物和1个羟基化产物;严春艳等[13]利用转基因何首乌毛状根对青蒿素等8种活性化合物进行生物转化，结果发现其中3个底物发生了生物转化;邓文娟等[14]研究显示，瑞香素在何首乌毛状根悬浮培养体系中发生了生物转化，生成了瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）。另外，还有关于何首乌毛状根对于麝香草酚、氯代香豆素、倍半萜类化合物[15-16]等物质的生物转化，都得到了不同程度的糖基化、氧化、还原等反应底物，可见何首乌在生物转化方面有着广阔的应用前景，对于丰富新化合物资源，甚至研制开发新药都是一个可行的方法，值得进一步研究挖掘。
　　4    何首乌毛状根在代谢工程方面的研究
　　药用植物次生代谢工程是利用基因工程的手段对次生代谢途径进行修饰、调控甚至改变，以期提高次生代谢产物的含量。何首乌含有二苯乙烯苷、蒽醌类等次生代谢产物，有利于提高植物的抗逆性，并且在治疗心血管疾病、炎症等方面表现出较好的效果，但是由于次生代谢产物含量的局限，次生代谢工程成为解决这一问题的有效途径。笔者前期研究表明[5]，芪合酶是何首乌二苯乙烯苷合成途徑的关键酶，将含有芪合酶基因的过表达质粒和RNA干扰载体导入野生型发根农杆菌ATCC15834中，转化何首乌外植体诱导生成毛状根，结果表明，芪合酶过表达的何首乌毛状根中二苯乙烯苷含量是空白组的2.41倍，而RNA干扰组则二苯乙烯苷合成明显减少。
　　5    总结及展望
　　现代药理学研究已经证明何首乌中二苯乙烯苷等次生代谢产物的诸多功效，但是由于次生代谢产物含量较低，原植物提取含量有限，获得生长迅速、稳定遗传的毛状根成为何首乌有效成分提取的一个重要来源。但目前对于影响何首乌毛状根生长及其次生代谢产物形成的因素研究还不够深入，有待进一步研究。利用何首乌毛状根进行生物转化的研究越来越多，给未来利用何首乌毛状根进行目标产物的大规模生产和商业化提供了可能。而随着次生代谢工程研究的深入，利用转基因技术获得基因改良的何首乌毛状根，从而在根源上提高二苯乙烯苷等有效成分的含量，也为将来大量获取有效成分提供了一条便捷的途径[17]。 　　6    参考文献
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