多糖提取纯化、化学修饰和抗氧化性研究进展

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　　摘要：多糖凭借其活性大、毒性低、天然、来源广等优点，已成为近年来人们研究的热点，对目前多糖的提取与分离纯化、化学结构修饰方法以及抗氧化活性研究进展进行了综述。
　　关键词：多糖;提取与分离纯化;化学结构修饰
　　中图分类号：R284.2         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）02-0005-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.001           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Advances in extraction，purification，chemical modification and
　　antioxidant activity of polysaccharides
　　MENG Shu-yu，MERWERT·Adalhan，XIAYIDA·Nurmamate，ADELE·Suleiman，MULLIDER·Hederbai，CHEN Chun-li
　　（College of Pharmacy，Xingjiang Medical University，Urumqi 830001，China）
　　Abstract： Polysaccharide has become a hot research topic in recent years because of its high activity， low toxicity， natural， wide source and so on. The extraction， purification， chemical structural modification and antioxidant activity of polysaccharide are reviewed.
　　Key words： polysaccharide; extraction and purification; chemical structural modification
　　多糖是由至少10個以上单糖组成的高分子碳水化合物，广泛分布于动植物界和微生物界，是机体能量的主要来源[1]。研究发现，多糖有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、促进免疫细胞分泌、抗凝血等作用，且多糖具有来源广、提取天然、毒性低、副作用小等优点，已成为研究者的研究热点。本文对多糖的提取分离、纯化、化学结构修饰以及抗氧化活性研究进度4个方面进行概述，以期为这方面的研究提供参考。
　　1  多糖的提取
　　多糖具有分子量大、结构复杂、合成困难、提取困难等特点。提取的多糖纯度越高，后续研究效率越高，故提取多糖成为了研究多糖的基础。多糖是极性大分子、易溶于热水、难溶于有机物，除传统的热水提取法外，还有微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶法提取等辅助方法。
　　1.1  热水提取法
　　热水提取法是多糖传统的提取方法，该法利用了多糖的水溶性，在热力学分子作用力下，细胞质壁分离，多糖透过细胞壁散布于水中，提取液经浓缩、反复沉降后，最终得到粗多糖[2，3]。热水提取法应用广泛，该法已应用于香菇多糖、茶多糖、南瓜多糖等的提取[2，4，5]。热水提取法的影响因素一般有浸取温度、提取次数、提取时间、液料比等，优化多糖提取工艺是提高得率的关键[3]。为了提高多糖得率，通常还会向水溶液中加入一定的酸、碱等，有时还会施加高压来辅助提取[2，6]。
　　1.2  微波辅助提取法
　　微波辅助提取法的原理是利用微波能的加热效应，加速溶剂对物料的溶解，该法有较好的选择性。微波辅助法有缩短提取时间、减少溶剂用量、促进有效溶剂溶出的优点，常应用于多糖的提取[7]。如黄芪多糖的提取，结果表明，微波辅助提取法提取黄芪多糖最优条件为固液比1∶40（g∶mL）、提取时间8 min、提取功率400 W、pH 8.5，在此提取条件下，黄芪多糖提取率可达79.912 mg/g[8]。在月见草叶多糖的提取中，微波辅助提取法提取率可达3.54%[9]。
　　1.3  超声波辅助提取法
　　超声波辅助提取法的原理为利用超声波对细胞进行破壁，加快细胞内容物的释放，从而提高提取效率，此方法具有操作简单、易于控制、时间短、收率高的优点，常用于多糖的提取[7]。如古尼虫草多糖的提取，用此法可使提取率达到1.82%[10]。
　　1.4  酶法提取
　　酶具有特异性强、选择性高的特点。酶提取法具有条件较温和、产物提取率高、提取时间短且易控制的优点，常与其他方法结合用于提取多糖[7]。如百合多糖的提取，在最佳条件（温度50 ℃、pH 7.0、酶解反应时间90 min）下，提取率为31.03%，是传统的热水提取法的3.58倍[11]。采用纤维素酶法提取山银花多糖，在最佳条件（酶解时间80 min、液料比14.6 mL/g、酶解pH 5.2、酶添加量8.0 mg/mL）下，多糖得率为16.05%[12]。纤维素酶法还可与超声波法结合显著提高提取率，如轮叶党参多糖的提取，在最佳试验条件（酶解温度45 ℃、加酶量0.7%、pH 4.5、酶解时间3 h、超声功率147 W、超声时间15 min、超声温度36 ℃）下，提取率可达11.77%[13]。
　　2  多糖的分离纯化
　　经过初步提取的多糖通常为粗多糖，常含有油脂、蛋白质、色素等杂质，而且相对分子质量分布较宽[14]。为了进一步研究其性质，还需要将多糖进行纯化，常用的方法为大孔树脂柱层析法、离子交换层析法、溶剂法等，而且通常情况下需要采用多种方法联合来纯化多糖。如张云侠[15]综合运用了DEAE-52阴离子交换层析法、凝胶柱层析法来纯化平菇多糖，最终得到PSPO-1a和PSPO-4a两种均一性多糖。 　　2.1  大孔树脂柱层析法
　　大孔树脂，又称全多孔树脂，属于聚合物吸附剂，它是一类以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用的高分子聚合物。其原理是依靠与被吸附物质之间的范德华力，增大比表面进行物理吸附，使有机化合物根据吸附力及其分子量大小，可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。不同的树脂类型对多糖的纯化效果不同，如肖珊等[16]用不同型号（HPD300、AB-8、HPD100、DM301、D101）的大孔树脂对枸杞多糖的纯化进行了研究，结果表明，在同等条件下，HPD300大孔吸附树脂对枸杞多糖的除杂率和保留率较为理想。
　　2.2  离子交换层析法
　　离子交换层析法是常用的多糖纯化方法，此法可分离具有不同带电荷性质的多糖，尤其适用于中性、酸性以及黏多糖的分级，此方法操作简便、上样量大、适合大规模多糖的分级，其常用层析材料为DEAE纤维素[17-19]。张涛等[20]采用了DEAE纤维素离子交换柱法对党参多糖进行了纯化分级，得到2种子级分多糖，产率分别为30.6%和19.8%。
　　2.3  葡聚糖凝胶柱层析法
　　葡聚糖凝胶柱层析法是凝胶柱层析法的其中一种，其原理是利用分子大小进行层析，分子大的先析出，分子小的在层析柱中停留时间长而后析出[21]。此法常与纤维素柱层析法合用，如连紫宛等[22]用DAEA-52纤维离子交换柱对雪灵芝粗多糖AKP进行了纯化分离，得5个分离组分AKP-1～AKP-5，并将AKP-2用葡聚糖凝胶G-75柱进行进一步纯化分离，得到AKP-2a，采用苯酚硫酸法测定了AKP、AKP-2、AKP-2a总含糖量，分别为52%、70%和79%，结果表明，葡聚糖凝胶柱层析法与纤维素离子交换柱法结合可提高纯化分离后的含糖量。除与纤维素柱层析法结合外，此法还可与琼脂糖凝胶层析法结合，这两种方法原理相同，用于分离分子量大小不同的多糖。如常清泉[23]利用葡聚糖凝胶层析法和纤维素柱层析对软枣猕猴桃茎多糖、软枣猕猴桃叶多糖、狗枣猕猴桃茎多糖、狗枣猕猴桃叶多糖进行纯化分离，得到8个均一多糖组分。
　　2.4  溶剂法
　　溶剂法又称为分级沉淀法，将粗多糖溶解于去离子水中，并向其加入适当的溶剂，使多糖沉淀，杂质溶于母液中，然后离心，过滤得到纯多糖，常用溶剂为（NH4）2SO4、乙醇等。如阙志强等[24]采用了（NH4）2SO4溶液纯化芦荟粗多糖，并经过透析除去（NH4）2SO4，冷冻干燥后得到芦荟多糖。乙醇还可与硫酸铵组成双相水体系用于分离多糖。于萍[25]在最佳条件（17%硫酸铵、27.9%乙醇、30 ℃、pH 3.22）下，对灰树花多糖进行了分离，得到纯度为66.7%的灰树花多糖。
　　3  多糖的化学结构修饰
　　多糖糖苷键的类型、主链的构型、支链的性质是影响多糖活性的主要因素。如香菇多糖和淀粉均是以葡聚糖為主链的多糖， 但香菇多糖有抗肿瘤的活性而淀粉没有，其原因是香菇多糖糖苷键构型为（1，3）而淀粉为（1，4）[26]。多糖自身的结构可以影响多糖的提取条件以及生物活性，改变其化学结构可以提高提取率、增强活性以及靶向性，故化学修饰成为研究多糖的又一方向。目前，常用的方法有乙酰化、硫酸化、羧甲基化、黄酰化、硒化等，可根据不同的多糖选择适当的修饰方法，可提高其产物活性。
　　3.1  硫酸化
　　多糖的硫酸化就是让糖羟基上带有硫酸根，常用的方法有浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸-吡啶法等[27]。其原理为让溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在一定条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团[28]。硫酸化能够提高多糖的产率和生物活性，结果表明，硫酸化后的多糖比硫酸化前的多糖具有更高的氧化活性，如硫酸化前，多糖对羟基自由基的清除率为41%，硫酸化后则提高到75%[29]。肝素是一种硫酸多糖，利用肝素和硫酸化多糖相似的结构，硫酸化后的多糖能够提高抗凝血活性[30]，如杨铁虹等[31]研究了硫酸化对当归多糖抗凝血活性的影响，结果表明，当归多糖硫酸化前，凝血时间为（6.44±2.42） h，硫酸化后凝血时间缩短为（1.95±1.56） h。多糖的硫酸化修饰可提高抗病毒活性，如刘旭[32]用水煎醇沉法从板蓝根饮片中提取板蓝根总多糖（IRPSt），并分离得到3种分级多糖IRPS1、IRPS2、IRPS3，采用氯磺酸-吡啶法对IRPS2进行硫酸化修饰，结果显示硫酸化后的多糖抗病毒活性明显高于未硫酸化的多糖。硫酸化还能够提高多糖的溶解性，如乌龙茶多糖在硫酸化前溶解率为4.8 mg/mL，硫酸化后提高到6.8 mg/mL[33]。
　　3.2  乙酰化
　　乙酰化修饰是指多糖支链上羟基被乙酰基团取代，该法使多糖结构伸展，让更多的羟基暴露，使其在水中的溶解度增加，并提高其活性，是一种常用的多糖修饰方法[34]，常用试剂为乙酸酐。乙酰化能够增强多糖的抗氧化活性、抗肿瘤活性以及免疫调节活性，如邵珠领等[35]在氢氧化钠水溶液中加入不同体积的乙酸酐制备了乙酰化桦褐孔菌多糖，结果表明随着乙酰基取代度的增强，其抗氧化活性逐渐增强。彭天元等[36]对枸杞多糖（LBP）进行乙酰化修饰得到其衍生物LBPa，并考察了LBP和LBPa对肿瘤细胞的抑制率、脾脏指数、胸腺指数、白介素（LI-2）、血清肿瘤坏死因子（TNF-α）的影响，结果表明，LBPa可显著抑制H22肿瘤细胞增殖，提高小鼠的抗肿瘤能力和抗氧化性，且LBPa的抗氧化效果优于阳性对照组维生素C和LBP。潘欣欣等[37]用乙酸酐法制备3种乙酰化修饰产物SLAMP-a1、SLAMP-a2、SLAMP-a3，结果表明，SLAMP-a1具有显著地促进脾细胞增殖作用。
　　3.3  羧甲基化
　　羧甲基化是将多糖与酸或羧酸衍生物的醚化，向多糖链上引入羧甲基[38]。羧甲基化的方法主要有水媒法和溶媒法，但由于水媒法的副反应较多，因此一般采用溶媒法。羧甲基化能够增强多糖的抗氧化活性，如李霞等[39]将肠浒苔多糖用氢氧化钠-氯乙酸的化学反应体系进行羧甲基化，得到不同取代程度的羧甲基化多糖，研究发现甲基化后，肠浒苔多糖对超氧阴离子的清除能力有大幅度提高，证明羧甲基化能够增强多糖的抗氧化活性。羧甲基化除可增强多糖抗氧化性外，还可增强多糖对化学性肝损伤的保护作用，如王杏[40]将桑葚多糖MFP-1进行羧甲基化修饰后得C-MFP-1，在建立小鼠急性肝损伤模型后，给小鼠灌胃不同浓度的MFP-1和C-MFP-1，结果显示，预先灌胃高浓度的MFP-1和C-MFP-1时，小鼠肝细胞的MDA值分别降为21.35±8.58和19.45±9.86，与空白对照组有显著差异，多糖羧甲基化后能增强对肝细胞的保护能力（MDA值可反映细胞损伤程度，数值越高损伤程度越大）。 　　3.4  硒化
　　硒化是利用多糖链上的羟基、氨基等活性基团与硒化试剂中的含硒化合物结合，从而将无机硒通过共价键接合在糖链上，形成硒多糖[41]。其主要方法有化学合成法、植物转化法、微生物转化法等。硒是生命活动的必需元素，硒化修饰能够改善多糖的生物活性。如连科迅[42]采用HNO3-Na2SeO3法对新疆乌拉尔甘草多糖（SeGUP）进行硒化修饰，结果表明，硒化后多糖的抗炎和免疫调节效果优于未硒化的多糖。胡成等[43]采用亚硒酸钠将肿节风浸膏残渣粗多糖进行硒化，硒化后肿节风浸膏残渣多糖比硒化前具有更高的抗肿瘤活性。
　　4  多糖的抗氧化性研究
　　4.1  对H2O2诱导HepG2细胞保护作用的影响
　　H2O2进入HepG2肝癌细胞后可形成高活性的自由基，引起脂质过氧化等反应，破坏细胞结构，引起细胞衰老。谢苗苗等[44]研究发现，HepG2在H2O2的作用下存活率为78.30%，加入1 000 μg/mL的金钗石斛多糖后，HepG2的存活率可达107.8%，结果表明，金钗石斛多糖能降低H2O2对HepG2的影响，从而起到抗氧化作用。
　　4.2  对OH·的清除作用
　　OH·是一种自由基，它能增强生物膜的通透性，从而加速细胞老化。多糖能够清除OH·，从而起到抗氧化作用。李容等[45]研究发现，硫酸化的川木瓜多糖在浓度为3 mg/mL时，对OH·的清除率可达 87.92%。李荣芷等[46]用MDA-TBA法测定了灵芝多糖对OH·清除效果，结果显示，灵芝多糖GLA、GLB、GLC对其清除率分别可达66.7%、57.6%、45.4%。孙玉姣等[46]考察了4种枸杞多糖组分（LBP1、LBP2、LBP3、LBP4）的抗氧化活性，结果表明，4种多糖均对OH·有良好的清除效果，其中效果最好为LBP4。除此之外，山银花多糖[12]、山霍石斛多糖[48]、月见草叶粗多糖[9]等均可清除OH·。若采用特殊方法提取多糖，还可增强多糖对OH·的清除作用。滕利荣等[11]研究发现，用酶法提取的百合多糖对OH·有显著的抑制作用，而水提多糖无此作用。
　　4.3  调节核酸和蛋白质代谢平衡
　　核酸和蛋白质是生命活动的基础，故其代谢对生命有重要影响，有研究发现老年人的核酸代谢和蛋白质代谢能力较低，修复能力差，错误的核酸和蛋白质增多，促进衰老[46]。而多糖能够调节核酸和蛋白质的代谢，从而起到抗氧化的作用。如灵芝多糖，能促进骨髓、血清、肝脏的蛋白质和核酸合成，并能一定程度上增加小鼠干细胞P450的含量[46]。
　　4.4  抑制H2O2对血红细胞氧化溶血的作用
　　H2O2可诱导血红细胞氧化溶血，导致机体衰老，而多糖能够抑制这一过程，如百合多糖。滕利荣等[11]取生理盐水和不同浓度的多糖溶液分别加入混有H2O2的红细胞悬浊液，结果表明，多糖能显著抑制H2O2对血红细胞氧化溶血的作用，且用酶法提取的多糖对红细胞溶血的抑制效果大于水提多糖。
　　4.5  对血清、肝脏组织中SOD、GSH-Px酶活性和MDA含量的影响
　　经研究发现，在衰老机体中，血清和肝脏组织中的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶活性均下降，MDA含量增多。多糖具有增强SOD、GSH-Px酶的活性、抑制MDA含量的作用，能有效减轻氧化损伤，梁启超等[49]对玫瑰多糖进行了体内抗氧化活性研究，研究结果显示，与衰老模型组相比多糖高剂量组血清和肝组织的SOD活性分别提高了18.17%、20.30%，GSH-Px活性分别提高了33.89%、33.32%，MDA含量降低了5.77%、39.72%，证明玫瑰多糖有增强SOD、GSH-Px活性和降低MDA含量的作用，能有效减缓机体氧化衰老。
　　4.6  对超氧离子自由基的清除作用
　　超氧自由基是一种人体内产生的活性氧自由基，能引发体内脂质过氧化，加快从皮肤到内部器官整个肌体的衰老过程[50]。多糖可清除超氧自由基，起到抗氧化作用，如枸杞多糖，在多糖浓度为3 mg/mL时，LBP4对超氧离子自由基的清除率可达85.13%± 1.55%[47]，山银花多糖[12]、山霍石斛多糖均对超氧离子自由基有一定的清除作用[48]。
　　4.7  对DPPH自由基的清除作用
　　DPPH又名1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种有效的自由基捕获剂。研究发现，枸杞多糖对DPPH自由基有清除效应，其中最强的是LBP1，在多糖浓度为3 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达80.41%±2.14%[47]。除此之外，當山银花多糖浓度为3.0 mg/mL时，其对DPPH自由基的半数抑制浓度可达0.941 mg/mL[12]，当月见草叶多糖质量浓度为3.5 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达40.58%[9]，当升麻多糖浓度达1.6 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达67.94%[50]。
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