质粒DNA提取方法的研究进展

来源:用户上传      作者:

　　摘 要：在生物实验中，质粒DNA常常作为基因载体运载工具使用，应用非常广泛，质粒DNA的提取通常在实验室内进行，保证其提取的效率和质量对生物实验研究具有重要意义，基于此本文对质粒DNA的提出方法进行了探讨。
　　关键词：质粒DNA;提取方法;研究
　　质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中，质粒DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。
　　在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行：第一步，培养细菌，使质粒扩增;第一步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒DNA的分离和纯化。在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA才能够更好的分离开来。细菌浓度对于质粒DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低;而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对这些方法的最新研究进行介绍。
　　1 碱裂解法
　　碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取DNA的时间都在1.5h以上。碱裂解法提取质粒DNA的基本原理：首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，使细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+螯合，起到抑制DNase活性的作用;然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质;再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。其中，该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH，正因如此该方法被称为碱裂解法，如果将其换为SDS，也能够提取出少量的质粒DNA，这是由于SDS也是碱性的，可以一定程度上破坏细菌的细胞膜。在这一方法中需要注意，NaOH溶液要现用现配，这个主要是由于其能够和空气中的CO2反应，从而使溶液的碱性降低，这样会影响提纯的效率，另外在加入溶液Ⅱ之后，操作时间不能够过长，这是因为染色体DNA在碱性条件下片段会慢慢断裂。另外需要注意的是，在操作过程中，混匀是一定要轻柔，从而在保证细菌沉淀可以充分的扩散在试剂中的前提下，避免已变性质粒DNA和染色体基因组DNA被机械剪切。此外，在溶液Ⅲ加入之后，其中的SDS会和蛋白质结合，会产生大量的沉淀，SDS还会和醋酸钾结合，生成PDS，这一物质的溶解度远低于SDS，从而可以将大部分蛋白质和染色体DNA共沉淀。
　　2 煮沸法
　　煮沸法的优点在于，能够在高菌体浓度的条件下进行质粒DNA的提取，应用这种方法可以是菌体裂解液浓度达到OD600等于100，能够达到碱裂解法的2.5倍。在进行质粒的提取时，提高提取效率十分重要，因此需要更提高处理样品的能力。在提取時，同一时间内，最好处理尽可能多的菌体，而菌体浓度比较高的情况下，可能会导致裂解不充分的问题，并增加后续操作的难度，影响到质粒DNA的提取效率和质量。通过煮沸法则可以有效的解决这一问题，这是特点也是煮沸法的主要优势所在。在传统的煮沸法中，裂解通常在100℃的热水浴中进行，如果温度过高的话，不仅难以控制好温度，同时会浪费比较多的能源。研究人员对煮沸法进行了优化，在连续热裂解方法中，增加了37℃温浴这一步骤，在热裂解之前先37℃温浴20min，在这样的条件下，裂解缓冲液中的溶菌酶以及Triton-X100可以充分的和菌体进行通，在这样的条件下，可以降低热裂解的温度，只需要70℃就可以满足要求，温度更加容易控制，而且能够节约能源。
　　3 SDS裂解法
　　SDS裂解法中，需要应用到3种裂解溶液，每种溶液的作用各不相同。其中，溶液Ⅰ的作用是对反应的pH值进行控制，通过控制pH值来使细胞壁溶解，从而增加细胞比重，从而使细胞悬浮起来;溶液Ⅱ的主要作用是使长链基因组DNA变性，并使其和蛋白质、细胞碎片等相互缠绕，最终形成大型的复合物，SDS会将这一复合物包覆起来，在这一过程中部分超螺旋的闭环环状质粒DNA也会出现可逆变性;在加入溶液Ⅲ之后，该溶液能够使整个系统恢复中性条件，从而使出现可逆变性的质粒DNA复性，同时接入溶液Ⅲ后，SDS还会和其中的醋酸钾出现反应，生成溶解度较低的PDS，从而使SDS包覆的大型复合物沉淀，离心之后就可以分离出质粒DNA。
　　4 结论
　　碱裂解法、煮沸法和SDS裂解法是比较常规的质粒DNA提取方法，其中，碱裂解法的特点是操作简便，提出的质粒DNA纯度较高，具有较高的提取效率，因此应用的比较广泛，应用此方法提取出的质粒DNA被广泛应用转化细菌、酶切分析以及DNA重组实验中;煮沸法则由于过程比较剧烈，容易导致质粒DNA结构的破坏，其优点是可以处理高浓度的菌液;SDS裂解法具有良好的提出纯度。
　　参考文献：
　　[1]刘辉.细菌质粒DNA基因的研究进展[J].北京医学，2007，29（2）：101-103.
　　[2]李卫玲，易初丽.质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展[J].江汉大学学报（自然科学版），2018，46（1）：62-66.
　　[3]李恒.大肠杆菌质粒DNA提取方法的研究[J].资源节约与环保，2018，199（6）：86.
　　作者简介：王佩菡（1997-），女，回族，山东济宁人，本科三年级，研究方向：健康科学。
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15099904.htm