石斛多糖对SHR晚期糖基化终产物代谢变化及其与炎症冈子的关系

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　　[摘要]目的 探讨石斛多糖对自发性高血压大鼠（SHR）炎症因子和晚期糖基化终产物代谢的效果及其剂量。方法 提取石斛多糖，将SHR随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组四组，对照组给开水，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别给石斛多糖100、300、500mg/d，干预2个月，比较干预后各组肿瘤坏死因子（TNF-α），白细胞介素（IL）-6，IL-10，晚期糖基化终产物（AGE），可溶性AGE受体（sRAGE）和全长AGE受体（RAGE）mRNA水平。结果 与对照组比较，低剂量组TNF-α水平比较，差异有统计意义（P<0.05），中剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计意义（P<0.05），高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计意义（P<0.05）。低剂量组sRAGE水平差异有统计意义（p<0.05），中剂量组sRA（-.E和RACE mRNA水平比较，差异有统计意义（P<0.05），高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平比较，差异有统计意义cP<0.05）。石斛多糖能够有效缓解SHR的炎症因子和晚期糖基化终产物代谢紊乱。其改善TNF-α、IL-6、IL-10、AGE、sRAGE和RAGE mRNA的作用有剂量效应关系，纠正SHR炎症因子功能紊乱的有效剂量为300mg/d;纠正SHR晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱的有效剂量为500mg/d。结论 石斛多糖可有效缓解SHR的炎症因子功能紊乱，降低AGE水平，提高sRAGE水平，降低RAGE基因的活化，对缓解SHR的血管重塑有积极的作用。其药效有剂量效应关系，中等剂量可有效改善炎症症状，高剂量能改善AGE及其受体症状。
　　[关键词]石斛多糖;炎症因子;晚期糖基化终产物;晚期糖基化终产物受体
　　[中图分类号]R285.5
　　[文献标识码]A
　　[文章编号]2095-0616（2020）01-09-05
　　晚期糖基化终末产物（advanced glycationendproducts，AGE）能够和身体的组织细胞相组合，导致慢性退化型疾病的发生，是全球医学界最为热门的领域之一，AGE受体（receptor for advancedglycation end-product，RAGE）是细胞表面分子的免疫球蛋白超家族成员之一，与AGE及蛋白质分子相互作用参与炎症反应，高水平的AGE可促进RAGE的表达，诱导细胞信号转导与促进AS的发生和发展有关[1]。可溶性RAGE（soluble receptor foradvanced glycationend products， sRAGE） 与RAGE结构相似，可竞争性地与AGE结合，对保护血管细胞，改善AS进程有积极的作用，成为临床药学关注的热点[2]。石斛（dendrobium）含有丰富的酚类、类萜类和含氮类等重要药用成分，具有滋阴清热，抑制炎症反应，增强免疫力等功效，在AS中发挥了积极的作用，但其作用的靶点及其机制还不完全清楚[3]。为探讨石斛对AS的疗效及其机制，本研究观察石斛多糖干预SHR后其肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-10、AGE、sRAGE和腹主动脉平滑肌RAGE mRNA表达水平的变异情况。
　　1 材料与方法
　　1.1铁皮石斛多糖
　　采用人工栽培铁皮石斛（广西根辽生物技术有限公司提供），经本校何思陆主任药师鉴定为铁皮石斛（Dendrobium candidum）。铁皮石斛多糖提取按文献[4]：取新鲜品铁皮石斛茎1000g，100℃杀青30min，60℃烘箱烘干24h，100目粉碎机粉碎，80℃热水浸提2h，离心、抽滤、浓缩至原有体积的1/6，醇沉24h，离心，真空干燥。热水回流加纤维素酶（Cellulase）纯化，水浴加热浓缩至含生药量为1g/100mL的药液，杀菌，贮存于4℃冰箱内备用。
　　1.2动物喂养与药饲
　　（1）自发性高血压大鼠（SHR）和饲料：SHR由中山大学北校园实验动物巾心提供，动物合格证号：SYXK（粤）2017-0081。选购2个月±2d龄雄性SHR大鼠48只，普通级。鼠饲料丸由上海新奇特种饲料厂提供。（2）喂养方法：鼠饲料丸架式笼养，室温（20±2）℃，相对湿度（75±5）%，光照明暗各12h交替，喂养至8个月±2d月龄，平均体重为（352+5）g时给予药物干预。（3）分组药饲：将48只SHR大鼠随机分为对照组、低剂量组、巾剂量组和高剂量组四组，每组12只共一笼饲养。（4）药物剂量：根据2010年版《中国药典》成人70kg推荐剂量10g/d，SHR体重0.35kg，按照人用量推算动物给药量，SHR等效剂量约为人的6.3倍，本研究用石斛剂量为：低剂量组100mg/d，中剂量组300mg/d，高剂量组500mg/d。（5）给药方法：低剂量组口腔给石斛多糖药饮100mg/d（取10.0mL药液加水40mL）;巾剂量组口腔给石斛多糖藥饮300mg/d（取30.0mL药液加水10mL）;高剂量组口腔给石斛多糖药饮500mg/d（取50.0mL药液），每天1次。对照组口腔给开水50.0mL/d。四组均等量喂鼠饲料丸，饮用水自由饮用，连续2个月。
　　1.3标本采集
　　于干预后麻醉SHR进行标本采集。（1）麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。（2）血液标本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打开腹腔，从腹腔静脉取血0.5mL，低温分离取血清。（3）标本采集：剪取腹主动脉平滑肌15mm×3mm组织，剪成5mm×3mm共3小块，分别置于3个冻存管，于30min内液氮固定4h，移至-70℃冰箱保存备检。
　　1.4标本检测
　　TNF-α、IL-6、IL-10和sRAGE测定用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，试剂盒由杭州沃森生物技术有限公司提供，用美国BIO RAD 550型酶标仪检测，严格按检测方法和程序进行。 　　1.5RAGE mRNA表达检测
　　用RT-PCR法，取100μL腹肌匀浆，用Trizol试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，取10μL，逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用。取5μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以β-actin为内参对照。根据Gene Bank人类RAGE基因（Gene Bank登录号AB036432）设计RAGE基因引物，由杭州联川生物技术有限公司设计合成。RAGE基因序列为F：5'一GGGGTACCAAGGAAGCAGGTAGGCAGCC-3';R：5'-CCGCTCGAATCCATTCCTGTTCATCTGC-3'，扩增长度328bp。管家基因序列为F：5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3';R：5'一AAACGCAGCTCAGTAACAG-3'，扩增长度225bp。PCR反应条件：55℃逆转录反应60min，94℃变性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循环，72℃延伸7min。胶回收试剂盒回收目的基因片段。PCR产物在琼脂糖凝胶巾电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct值，采用2-△△Ct相对定量计算公式计算分析。
　　1.6统计学分析
　　应用SPSS20.0版本软件进行统计处理，计量资料以（χ±s）表示。两组资料比较采用独立样本t检验，多组资料比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1石斛多糖对SHR血清TNF-α、IL-6和IL-10水平的影响
　　与对照组比较，低剂量组TNF-α水平差异有统计意义（P<0.01），巾剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05），高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义（P<0.01）。与低剂量组比较，巾剂量组TNF-α水平差异有统计学意义（P<0.01），高剂量组TNF-α、IL-6和IL-10水平差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。与巾剂量比较，高剂量组TNF-α和IL-6水平差异有统计学意义（P<0.01）。提示石斛多糖能有效纠正炎症功能紊乱，表现为降低TNF-α和IL-10水平，提高IL-6水平，治疗SHR炎症因子的有效剂量为石斛多糖300mg/d，连用2个月。将剂量提高到500mg/d，其纠正炎症功能紊乱效果差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　2.2石斛多糖对SHR血清AGE、sRAGE水平和动脉平滑肌组织RAGE mRNA表达的影响
　　与对照组比较，低剂量组sRAGE水平差异有统计学意义（P<0.01），中剂量组sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05），高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义（P<0.01）。与低剂量组比较，巾剂量组sRAGE水平差异有统计学意义（P<0.01），高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义（P<0.01）。与巾剂量组比较，高剂量组AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差异有统计学意义（P<0.01）。提示石斛多糖能有效纠正晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱，表现为提高sRAGE水平，降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效纠正SHR AGE及其受体功能紊乱的有效剂量为500mg/d，连用2个月。见表2。
　　3 讨论
　　有关糖基化产物（AGE）及其特异性受体（RAGE）的结构及其对各种疾病病理机制作用的共识正在不断更新，AGE是一种对机体有害的高度活性的羰基化合物，营养物质经过美拉德（Maillard）反应产生的终末产物，AGE在非酶促条件下，营养物质中的蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子游离的氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后等美拉德反应产生的，首先大分子末端的还原性氨基与还原糖分子中的醛基发生加成反应，形成希夫碱（Schiff bases），其次希夫碱再发生阿马道里（Amadori）重排，形成早期糖基化产物醛胺类，再次醛胺类再经过脱水，重排反应生成乙二酸（草酸），3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG）和甲基乙二醛（丙酮醛）等AGE[5]。体内AGE的主要来源一是食物中存在通过进食将AGE摄入体内，另外当体内葡萄糖浓度异常增高时，体内AGE的合成加速，分解减缓[6]。当AGE异常增高时，细胞表面的RAGE与AGE配体相互作用产生效应，导致许多慢性退化型疾病的发生[7]。人类RAGE编码基因位于6号染色体上，包含11个外显子和10个较短的内含子[8]。RAGE是一类模式识别受体，正常情况下RAGE表达量很低，当机体出现AGE聚集，RAGE表达量上调，激活如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3 kinase，PI3K）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases.MAPK）、应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、信号传导及转录激活因子（signal transducers and activatorsof transcription，STAT）等多种信号传导通路的级联放大反应，激活下游核转录因子（NK-K B）等，调节多种基因的转录表达，炎症因子释放，导致血管通透性增高，单核细胞粘附，基质成分增多等病理变化，在动脉粥样硬化损伤的发生发展巾发生作用[9]。研究认为，AGE与RAGE配体结合后，RAGE将信号传递至胞内，从而引发由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、细胞外信号调节激酶、p38丝裂原蛋白激酶和NF-KB等构成的信号转导途径[10]。虽然AGE与RAGE配体结合后RAGE首先与哪种蛋白结合，目前还不完全清楚，但对RAGE多聚核糖体mRNA研究发现，RAGE有3种主要的剪接变异体，分别为全长膜结合型（RAGE）、截去C端可溶型（sRAGE）和截去N端膜结合型。RAGE有完整的胞外段、膜镶嵌区和胞内段;sRAGE为RAGE的胞外段部分，缺少跨膜镶嵌区和胞内段;膜结合型仅有膜镶嵌区和胞内段，没有胞外段部分[11]。因此只有RAGE和sRAGE能与配体结合，膜结合型由于缺失胞外段不能与配体结合。而sRAGE缺少跨膜镶嵌区和胞内段，其AGE配体结合后，信号不能传递至胞内，不会发生信号传导通路的级联放大反应，同时sRAGE可与RAGE竞争结合其配体，对机体的多种病理状态起到保护作用[12]。降低AGE，阻断RAGE表达量上调，刺激机体产生更多的sRAGE等，被认为是缓解氧化应激，预防动脉粥样硬化及其并发症的方向标[13]。肿瘤坏死因子超家族和白细胞介素是重要细胞因子之一，其通過免疫原、丝裂原等刺激剂诱导产生并通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式在靶器官巾发挥作用，机体在遭受各种有害刺激时，致病因子TNF-α，IL-10产生过多，保护因子IL-6受抑，促进动脉粥样硬化损伤[14]。祖国医学认为风寒暑湿燥火等从经络传人脏腑，导致痰浊、血瘀、痰瘀交阻是糖基化产物代谢紊乱慢性血管疾病的病机，是“痰浊”辨证的客观表现，早在东汉时期，张仲景在《金匮要略》巾描述石斛具有益气健脾，理气活血，补脾益阳等功效，是温阳健脾的重要代表方剂，现代药理学认为石斛多糖有抗炎、抗病毒、调节免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究结果显示，用石斛多糖干预自发性高血压大鼠，可明显增高其IL-6和sRAGE水平，降低其TNF-α，IL-10，AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通过降低AGE生成和积累，提高sRAGE表达，抑制RAGE活化，改善SHR大鼠炎症功能紊乱状态，在SHR的血管损害病理过程中起到保护性作用。中医认为动脉粥样硬化性疾病本为阴阳失调，标为内生之风、痰浊和瘀血。治疗上应当用活血化瘀，行气通络，豁痰利气等[16-22]。本研究结果提示，石斛多糖可有效缓解SHR的炎症反应和晚期糖基化终末产物及其受体功能紊乱状况。石斛多糖对改善SHR的症状有剂量效应关系，改善炎症症状巾等剂量，改善晚期糖基化终产物及其受体症状的剂量比较高。石斛多糖为治疗血管重塑提供新型的空间。 　　[参考文献]
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　　（收稿日期：2019-04-09）
　　[基金项目]国家自然科学基金（81060028）;广西重大专项基金（桂科重1598005-9，桂科攻1355005-3-7）;广西卫生基金（GXZC1242）。
　　通讯作者
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