硼酸盐亲和色谱法检测糖化血红蛋白的分析性能评价
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摘要：目的 評价硼酸盐亲和色谱法（AC-HPLC）检测糖化血红蛋白（HbA1c）的分析性能。方法 参考美国临床与实验室标准化协会（CLSI）发布的方法学评价系列文件（EP文件）及相关文献，对Premier Hb9210系统检测HbA1c的精密度、正确度、分析测量范围以及生物参考区间进行验证，并与厂商声明的性能和有关质量标准进行比较。结果 硼酸盐亲和色谱法检测HbA1c两个不同水平的批内精密度（CV%）分别为0.8%和0.6%;总精密度（CV%）分别为1.53%和0.9%。与离子交换高效液相色谱法（IE-HPLC）的VariantⅡ检测系统的相对偏倚为3.26%。与来源于美国国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）定值样本靶值的相对偏差为2.3%～3.2%，HbA1c浓度为4.1%～16.4%，理论值与实测均值呈线性相关，回归方程为Y=1.0018x+0.3903，r2=0.9942。随机选择的20名健康参考个体糖化血红蛋白浓度均在厂商提供的参考区间内。结论 Premier Hb9210糖化血红蛋白分析仪的主要分析性能达到了厂商声明的性能和有关的质量要求，适用于我室检测糖化血红蛋白。
关键词：糖化血红蛋白;硼酸盐亲和色谱法;性能评价
中图分类号：R446.6 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.023
文章编号：1006-1959（2020）04-0077-03
Abstract：Objective To evaluate the analytical performance of glycosylated hemoglobin （HbA1c） by borate affinity chromatography （AC-HPLC）. Methods Refer to the Methodological Evaluation Series Documents （EP files） and related documents issued by the American Society for Clinical and Laboratory Standardization （CLSI） to verify the precision， accuracy， analytical measurement range and biological reference interval of the Premier Hb9210 system for detecting HbA1c And compare with the manufacturer's stated performance and relevant quality standards.Results The intra-batch precision （CV%） of two different levels of HbA1c detected by borate affinity chromatography was 0.8% and 0.6%， respectively; the total precision （CV%） was 1.53% and 0.9%. The relative bias of the Variant II detection system with ion exchange high performance liquid chromatography （IE-HPLC） was 3.26%. The relative deviation from the target value of the fixed sample from the National Glycated Hemoglobin Standardization Program （NGSP） is 2.3% ～ 3.2%， the HbA1c concentration is 4.1% ～ 16.4%， the theoretical value is linearly related to the measured mean， and the regression equation is Y=1.0018x+0.3903，r2=0.9942.Glycated hemoglobin concentrations of 20 randomly selected healthy reference individuals were within the reference interval provided by the manufacturer.Conclusion The main analytical performance of Premier Hb9210 glycated hemoglobin analyzer has reached the performance and relevant quality requirements declared by the manufacturer.
Key words：Glycated hemoglobin;Borate affinity chromatography;Performance evaluation 糖化血红蛋白A1c（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）是评价糖尿病患者长期血糖控制的金标准。2010年美国糖尿病联合会（American Diabetes Association，ADA）已将HbA1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准之一[1]，在我国2型糖尿患者群中开展的临床研究显示，二甲双胍可使HbA1c下降0.7%～1.0%[2，3]。HbA1c测定作为糖尿病流行病学和糖尿病长期控制情况的重要指标，近年来备受关 注[4，5]，我国由于不同检验机构，尤其是基层检验机构的溯源性（正确性）和稳定性存在较大问题[6]，因此实验室需要提供快速、准确、精确和低成本的实验方法。
1资料与方法
1.1检测系统 HPLC采用Premier Hb9210硼酸盐亲和色谱法测定，校准液、试剂、质控物由原厂家提供。
1.2实验基本要求 实验前严格按照厂商操作规程进行仪器的维护保养和校准，以确保仪器处于良好状态。实验过程中严格按照室内质量控制程 序进行常规室内质控，在质控在控的情况下进行实验。
1.3精密度实验 参考EP15-A2[7]文件，选取与厂商性能相近的2个浓度的新鲜患者全血标本作为实验样本，每天分析1批，每批重复测定3次，每天检测2个浓度水平，连续测定5 d。
1.4正确度实验 参考EP15-A2文件，将Premier Hb9210检测系统与VariantⅡ检测系统进行可比性试验，以通过美国国家糖化血红蛋白标准化计划（National Glycohemoglobin Standardization Program，NGSP）Ⅰ级实验室认证的VariantⅡ检测系统为参比系统，选取20份患者标本，分4 d，每天检测5个标本，每个标本分别在上述2个检测系统中进行测定，并进一步用AC-HPLC法对6份NGSP定值样本进行检测，每1样品重复测定2次。
1.5分析测量范围（AMR）实验 参考EP6-A[8]文件，选择低浓度（L）和高浓度（H）患者标本各1份，按 5L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，5H等比关系配制形成系列浓度全血。每个实验样品在检测系统上重复测定2次，记录结果。采取平均斜率来确定系列样品应含有的待测物的预期值（X），所有样品重复测定的均值为实测值（Y），将所有结果点在X-Y坐标图上，计算回归方程：Y=bx+a。若相关系数r≥0.975，b在0.97～1.03范围内，a与0无显著性差异（做t检验判断a与0是否有差异性），则可判断线性范围。
1.6参考区间验证 参考C28-A2[9]文件，选取中山大学附属中山医院体检中心20例健康体检人员进行HbA1c检测，检测结果用“1/3”规则进行离群值检验，剔除离群值，并用新的参考个体代替。若标本中不超过2份标本的检测值超出参考区间，则现行的参考区间可以接受。
1.7统计学分析 利用Excel 2013和 SPSS 17.0对结果进行数据分析。
2结果
2.1精密度实验结果 低水平批内不精密度CV=0.8%，总不精密度CV=1.53%，高水平批内不精密度CV=0.6%，总不精密度CV=0.9%，结果均小于厂家声明的2%，精密度性能得到验证。不同浓度的HbA1c测定的不精密度见表1。
2.2正确度实验结果 ①两种方法的偏倚散点、检查偏倚见图1。两种方法间在检测的浓度范围内标本结果差异相对一致，计算其相对偏倚为2.83%，小于1/2 CAP TEa，正确度性能得到验证;②对6份NGSP定值样本进行检测，结果见表2。比对系统与目标系统相对偏倚在2.3%～3.2%，均小于NGSP 规定的6%的可接受标准。
2.3分析测量范围（AMR）结果 对预期值和实测值进行回归分析，结果见图2。回归方程为Y=1.0018x+0.3903，r2=0.9942.从上述直线回归结果得知，r2=0.9942，说明组成回归线的所有数据点紧密贴近回归线，期望值和实测值之间相关性极好;b=1.0018，在0.97～1.03之间，与1之间无差异;a=0.3903，可以认为a与0之间无差异，直线实际上通过原点。在实验室所涉及的浓度范围（4.1～16.4）内呈线性。
2.4参考区间验证结果 20例健康参考个体均在参考区间范围内，验证通过。
3讨论
目前，国内外临床实验室常用的HbA1c测定方法主要是离子交换HPLC法、免疫化学法及亲和层析法。离子交换HPLC法是检测HbA1c的参考方 法[10]，但该法仪器较昂贵并需要专业人员操作。本系统测定原理是利用硼酸盐如苯硼酸结合在柱载体的表面，当含有蛋白（红细胞溶解液或血浆稀释液）的溶液通过色谱柱时，糖化成分通过其二醇结构和硼酸盐络合并保留在柱上。将未被保留的非糖化成分由柱上洗脱下来后，再通过一种试剂将糖化成分由硼酸盐中置换出来并由柱上洗脱下来。计算机处理分光光度检测器的信号并计算糖化血红蛋白或糖化血浆蛋白的浓度作为总检测水平的百分比。本法不受如血红蛋白变异体、非糖化修饰和存储导致的溶血等常见因素的干扰[11]。
我国卫生行业标准规定的实验室内CV应不大于3%，并尽量控制在2%以内[12]。本研究结果显示，AC-HPLC法的批内不精密度CV均小于1.0%，总不精密度CV均小于2.0%。证实AC-HPLC法的精密度均达到了上述要求，精密度性能良好。本实验室IE-HPLC法测定HbA1c参加卫生与计划生育委员会临床检验中心和广东省临床检验中心组织的室间质评成绩合格，参加上海HbA1c一致性计划成绩合格，且已通过了NGSPⅠ级实验室认证，分析性能良好，检测结果可溯源至NGSP的参考方法。CAP对HbA1c室间质评TEa为靶值×（±6%）[13]，以方法间相对偏倚≤靶值±1/2TEa 即≤靶值×（±3%）判断实验方法和比较方法间结果是否具有可比性。本研究20个患者样本的比对结果计算的相对偏倚3%内，小于CAP 1/2Tea，证实AC-HPLC法的正确度达到了上述要求。同时6份NGSP定值样本相对偏倚均小于NGSP 规定的6%的可接受标准，进一步证实AC-HPLC法正确度性能良好。本研究表明AC-HPLC法测定HbA1c的线性范围为4.1%～16.4%。但由于低于4.1%和高于16.4%浓度范围的样本不容易获得，故这部分浓度样本的线性有待进一步验证。参考区间验证结果20例健康体检者HbA1c（%）全部在參考区间4%～6%内。由于缺少变异血红蛋白标本，本研究未对由此引起的干扰进行验证。 综上所述，Premier Hb9210检测HbA1c具有操作简单、标本量少、检测速度快等优点。本研究验证精密度、正确度、分析测量范围以及生物参考区间均符合厂商声明的性能和有关质量标准的测定要求，适用于我室临床检测HbA1c。
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收稿日期：2019-11-30;修回日期：2019-12-25
编辑/肖婷婷
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