邻苯二甲酸酯类化合物免疫检测技术研究进展

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　　摘要：邻苯二甲酸酯（PAEs）类化合物是一种被广泛使用的环境激素类塑化剂，其对环境和人类健康的危害已经引发多方关注，该类物质的检测，特别是简便快速检测对于保障环境食品安全及消费者健康具有重要意义。目前，已有一系列免疫快速检测技术以其简单快速、低成本、高灵敏、高特异性、高通量的优势而被应用于PAEs检测，可以弥补色谱检测技术设备昂贵、操作繁琐、需要专业技术人员、难以实现大量样品筛选目标等不足。本文介绍了PAEs抗体及其免疫快速检测技术的研究进展，并进行评价和展望，以期为PAEs快速检测技术的发展和应用提供指导和帮助。
　　关键词：邻苯二甲酸酯;塑化剂;免疫检测;研究进展
　　中图分类号： X132;TS207文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0033-08
　　收稿日期：2019-01-09
　　基金项目：中国博士后基金（编号：2016M601745）;江苏大学高级人才启动基金（编号：16JDG035）。
　　作者简介：崔 银（1994—），女，江苏镇江人，硕士研究生，主要从事有毒有害物质的快速分析研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：candyminicy@163.com。
　　通信作者：杜道林，博士，教授，主要从事环境污染物的生态效应和毒理研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：ddl@ujs.edu.cn。
　　邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，简称PAEs，别称酞酸酯）类化合物是广泛存在的一类环境激素类塑化剂，其作为增塑剂、软化剂、载体及添加剂，被广泛用于塑料、汽车、润滑剂、化妆品、服装、农药等行业[1-4]。PAEs具有很强的生物富集性和抗降解性，不仅对人体生殖、发育有很大影响，对神经系统也有较大危害，此外还有致癌风险和环境生态风险[5-8]。随着长期使用和暴露，PAEs在环境介质中释放和进入食物供应链，导致其在大气、水体、土壤和食品中均有不同程度的检出，对环境和人体有极大的风险[9-11]。
　　2011年“中国台湾塑化剂风波”和2012年“大陆白酒塑化剂事件”使PAEs为广大消费者熟知并引起一定程度的恐慌[12-13]。近年来，PAEs的环境食品污染和毒理学研究已经受到广泛关注并成为当前的研究热点。PAEs种类繁多，其20余种常见品种及其化学结构式见表1，最常见的是DBP、DEHP，其中DEHP已经被美国国家环境保护局（Environmental Protection Agency，简称USEPA）列为2B类致癌物[14]。许多国家已经将多种PAEs确定为环境优先控制的污染物，并制定限量或禁用标准。美国不允许在食品接触材料中添加DBP、DIBP和DEHP，要求儿童玩具或儿童护理用品中6种PAEs（DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP、DnOP）的总含量不得超过0.1%[15]。欧盟指令2008/105/EC规定，地表水中DEHP的限值为1.3 μg/L。此外，欧盟不允许在食品接触材料中添加DIBP，允许DBP、DEHP在非油脂食品接触材料中使用，迁移限量为0.3 mg/kg[16]。原中国卫生部规定（卫办监督函[2011]551号），食品及食品添加剂中DBP、DEH、DINP的最大残留量分别为0.3、1.5、9.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》中水质参考指标及限值规定，DEP的限值为0.3 mg/L，DBP的限值为0.003 mg/L，水质非常规指标及限值规定，DEHP的限值为0.008 mg/L[17]。
　　关于PAEs检测方法的报道以气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（HPLC-MS）等色谱检测技术和一系列免疫快速检测技术为主。加强PAEs检测技术，特别是高灵敏、简便快速、高通量筛选、现场检测方法的应用，对于保障环境生态安全和食品消费安全尤为重要。本文重点阐述国内外广泛关注的PAEs免疫快速检测技术的研究进展，以期为PAEs快速检测技术的发展和应用提供研究思路和方向。
　　免疫快速检测方法的灵敏度和特异性与抗体的质量和分析方法的类型密切相关。半抗原、人工抗原、抗体、标记物是免疫分析的基本要素，其中抗體是免疫分析的核心试剂，半抗原、抗原的合成是小分子化合物抗体制备和分析方法建立的关键步骤[18]。研究表明，半抗原的结构、连接臂的长度和结构及其活性基团的连接位点、抗体获得途径对抗体的特异性识别和灵敏度具有不同程度的影响。
　　1.1 抗原
　　对PAEs类塑化剂的化学结构式进行分析可知，该类化合物拥有1个相同刚性平面芳烃-邻苯二甲酸酯基团，区别在于2个可塑的非线性脂肪侧链基团。因此，PAEs半抗原化学合成改造也具有相似的途径。分析当前的报道可知，目前主要采用3种策略合成PAEs半抗原。第1种策略如Ius等以4- 羟基邻苯二甲酸、甲醇为原料，合成4-羟基DMP后，与羧甲基羟胺半盐酸盐进行化学反应，获得带有—COOH间隔臂的DMP目标半抗原[19]。第2种策略如Yanaihara等以4-硝基邻苯二甲酸和甲醇为原料，从DMP分子苯环的酯基间位引入—NO2，合成4-硝基DMP，酯化反应和还原反应后获得4-氨基DMP半抗原[20]。第3种策略如Tang等在DMP的苯环酯基间位引入—NH2后，通过缩合反应与羧甲基羟胺半盐酸盐、丁二酸酐分别合成了2种长度—COOH间隔臂的DMP半抗原[21]。在PAEs免疫分析研究中，研究人员主要采用上述第2种策略，即从PAEs分子苯环酯基间位引入—NH2活性基团的策略化学合成半抗原。在随后的研究中，研究人员同样采用第2种策略分别合成DCHP、DMP、DPrP、DIBP、DEP和DBP的4-氨基半抗原[22-31]。
　　在PAEs半抗原合成的基础上，研究人员通常采用重氮法将—NH2化半抗原与牛血清白蛋白（BSA）或鸡卵清蛋白（OVA）分别偶联获得免疫抗原和包被抗原，采用碳二亚胺法将—COOH半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原。 　　1.2 抗体
　　研究人员用制备获得的人工免疫抗原免疫新西兰大白兔，从兔血清中分别纯化获得DCHP多克隆抗体、DPrP多克隆抗体、DIBP多克隆抗体、DEP多克隆抗体、DBP多克隆抗体和DMP多克隆抗体[22，24-26，28，30，32-33]。Wei等通过小白鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和抗体生产等流程，获得DBP单克隆抗体[29，31]。Ius等用连接臂较长的DMP半抗原偶联蛋白制备抗原后免疫新西兰大白兔，获得的多克隆抗体对DMP和其他多种PAEs均表现出较高程度的亲和力，可以作为广谱抗体对多种PAEs塑化剂进行多组分检测，表明较长的间隔臂有利于制备广谱PAEs抗体[19，21]。
　　2 PAEs免疫的快速分析检测
　　根据检测模式、载体和标记物的不同，多种免疫快速检测技术被开发用于PAEs的分析检测。研究人员将各种免疫分析模式和标记物质用于PAEs的快速分析检测，开发获得一系列免疫分析方法，并对方法的性能开展详细的评估，使PAEs分析检测技术得到极大的丰富，可以为PAEs安全风险监控储备关键技术和重要生化材料。
　　2.1 微孔免疫分析检测
　　2.1.1 酶免疫分析检测 作为免疫分析方法的经典方法和基础方法，酶联免疫吸附分析方法（ELISA）被广泛用于PAEs分析方法的开发和应用中，其中针对DMP、DBP的ELISA研究最多，也最深入。Zhang等将DMP多克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）偶联获得酶标记抗体，建立直接竞争ELISA（dc-ELISA）检测DMP，线性范围为0.1～2 000 ng/mL，检测限为0.09 ng/mL，与其他结构类似物的交叉反应很低（<8.8%）[23]。Sun等在将DMP抗体生物化的基础上，建立生物素-链霉亲和素放大ELISA方法检测DMP，检测范围为24～6 027 ng/mL，IC50为356 ng/mL，检测限（LOD）为8.2 ng/mL，特异性较高，与类似物的交叉率低于10%，在检测实际牛奶和奶制样品中表现出很高的准确度和精密度，并用GC-MS验证其检测结果[27]。Wei等采用聚乙烯微孔表面羧基化和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）偶联反应将半抗原4-氨基DBP直接固定，建立基于单克隆抗体DBP的间接竞争ELISA（ic-ELISA）方法，相比于将包被抗原固定在微孔表面（IC50为106 ng/mL），这种直接固定半抗原的策略使灵敏度得到很大提高（IC50为14.6 ng/mL）。在特异性方面，除了对BBP的交叉率为21.3%外，其余的均低于7.98%，在食品样品检测中也表现出良好的准确性和精确性，并通过GC-MS验证[29]。万宇平等建立白酒中DBP检测的ELISA方法，并研制成功试剂盒应用于白酒样品的检测，方法检测IC50为86.5 ng/mL，检测范围为0～1 620 ng/mL，在特异性方面对DIBP有45%的交叉率，对其他的交叉率均较低[34]。Xu等建立ic-ELISA检测白酒中的DBP，检测限达到64.5 ng/mL，检测范围为64.5～1 606.2 ng/mL，并与GC-MS进行比对，发现其相关系数为0.928[30]。Sun等将DBP多克隆抗体生物素化，建立生物素-亲和素系统放大的ELISA检测方法，检测限达到5 pg/mL，IC50为0.36 ng/mL，检测范围为0.45～7.06 ng/mL，具有很高的特异性（<3.8%），在饮料和应用水检测中发现0.45～7.06 ng/mL的DBP被检出[35]。Zhou等设计合成DBP半抗原和人工抗原，制备获得单克隆抗体，建立的ELISA的最低检测限为0.06 ng/mL，IC50为7.34 ng/mL，具有很高的特异性（<1.25%），该方法比多克隆抗体提高了1 000 倍的灵敏度，比其他报道的单抗灵敏度高5倍，并被应用于人类尿液中DBP含量的分析检测。结果表明，在1 246份尿液样本中，有72.87%的检出率，浓度为0～42.98 ng/mL，年轻人体内的浓度低于年长者体内的浓度[31]。
　　关于其他几种PAEs的ELISA报道主要有DPrP、DEP、DEHP。Zhang等将DPrP包被抗原和HRP偶联作为标记物，建立直接竞争化学发光ELISA（CL-ELISA）用于水样、牛奶样品中DPrP的检测，IC50为0.19 ng/mL，LOD为0.03 ng/mL，交叉反应率低于9%，样品未经净化处理和浓缩，表现出很小的基质影响，很好地展示出该免疫分析方法的简便性[24]。Zhang等建立DEP的ic-ELISA，检 测 范 围为0.005～18.6 ng/mL，检测限为0.004 9 ng/mL，与其他结构类似物的交叉反应率很低（<9%），在果汁、奶茶、纯奶和酸奶样品中的添加回收率在91.1%～109.3%之间[26]。Zhang等制备获得DEHP多克隆抗体并与HRP偶联作为检测探针建立了dc-ELISA方法，最低检测限为0.004 2 ng/mL，检测范围为0.001～1 000 ng/mL，与结构类似物的交叉反应率低于1%，并且被成功应用于婴儿用品中DEHP的检测[36]。
　　2.1.2 荧光免疫分析检测 荧光免疫分析方法（FIA）以荧光物质作为标记物，荧光信号赋予该分析方法更高的特异性和更高的光量子效率，使检测准确性和灵敏度获得进一步提高。Zhang等建立了基于多克隆抗体的DBP间接竞争FIA，方法检测限为0.02 ng/mL，IC50为10.53 ng/mL，检测范围为0.1～300 ng/mL，与其他PAEs塑化剂的交叉率低于9.6%，并对稻田水、河水、自来水、矿泉水进行了添加检测[28]。Zhang等将异硫氰酸荧光素（FITC）和羊抗兔二抗偶联制备荧光标记二抗，结合制备的DCHP兔源多克隆抗体建立了FIA，DCHP检测范围为0.1～200 ng/mL，检测限为0.05 ng/mL，特异性较高[交叉反应率（CR）<8.7%]，在多种水样检测中均表现出良好的重现性[22]。Zhang等在用dc-ELISA检测DMP的研究中，还将DMP多克隆抗体和FITC偶联制备荧光标记抗体，建立了DMP直接竞争FIA（dc-FIA），线性范围为0.05～30 ng/mL，检测限为0.02 ng/mL，在使用同种抗原和抗体的情况下，灵敏度较dc-ELISA提高了4倍以上，并被应用于水样的检测[23]。Zeng等在制备特异性DBP单克隆抗体的基础上，建立FIA分析方法对DBP在小鼠体内的分布进行了检测，并建立了ic-ELISA检测小鼠不同脏器内DBP的累积情况，将免疫分析技术很好地应用到生物活体检测方面[37]。Cui等制备获得DIBP多克隆抗体和羊抗兔-FITC，建立间接竞争FIA方法用于食用油样品中DIBP的检测，方法检测限达到5.82 ng/mL，IC50为61.2 ng/mL，检测范围为10.47～357.06 ng/mL，方法具有很高的特異性（CR<1.5%）[25]。 　　2.1.3 均相免疫分析检测 免疫分析检测从非均相模式转变为均相模式将使分析检测步骤更加简便，检测时间明显缩短，偏振检测技术、磁分离技术的应用可以实现均相模式的检测，进而简化检测程序和提高检测效率。Tian等用FITC标记DEP抗体，开发了DEP的荧光偏振免疫分析方法（FPIA），检测限为6.0 ng/mL，IC50为40.4 ng/mL，线性范围为10～200 ng/mL，瓶装水样品的检测限为1.46 ng/mL，果汁样品的检测限为340 ng/mL，药物胶囊样品的检测限为50 000 ng/g，3种样品的回收率为85.9%～114.9%，相对标准偏差为4.3%～17.0%[38]。笔者所在研究室的Zhu等将DEP多克隆抗体通过羊抗兔二抗定向负载在磁珠表面，包被抗原与铕离子螯合剂偶联作为标记物，建立了1种磁珠均相直接竞争时间分辨荧光免疫分析方法（TRFIA），方法的检测限达到5.92 pg/mL，并且被应用于镇江市水环境中的DEP分布检测，实际检测到的DEP浓度为2.98～306.19 ng/mL[39]。這2种PAEs免疫分析技术将均相模式、磁分离的高效性和荧光信号的高灵敏度结合，使检测能力显著提升，可为其他物质高灵敏、均相、高效痕量检测提供参考。
　　2.2 超灵敏PCR免疫分析检测
　　随着人类对环境和食品安全意识的提高，对有毒有害物质的检测也提出了更高要求。在此情形下，能够准确灵敏地检测样品中超低含量有毒有害物质的检测技术被极大地需求和欢迎。Sun等报道了基于金纳米颗粒的实时定量-免疫PCR分析技术用于DEP的超高灵敏度检测，检测范围为4 fg/mL～40 pg/mL，检测限为1.06 fg/mL，特异性很高（CR<5%），进而被用于食品中DEP的痕量检测[27]。该报道将免疫分析和超灵敏PCR技术结合，使得DEP的检测灵敏度得到极大提高（理论提高3个数量级以上），是当前灵敏度最高的标记检测策略，对于其他有毒有害物质的超痕量检测发展具有重要指导价值。
　　2.3 多组分免疫分析检测
　　随着PAEs塑化剂在环境中长期暴露，环境样品中同时存在多种PAEs的可能性大大增强，当前主要是针对单一组分的检测方法难以满足多组分同时检测的需求。为了扩大免疫分析的检测范围，研究人员将研究目标投向多种分析物分析，也叫作宽谱特异性分析、多组分分析或宽选择性分析[40]。区别于单组分分析的是，多组分分析可以对多种分析物进行总量的检测或分别进行定量检测，在初筛或初检中是一种很好的方法[41]。Ius等将多克隆抗体生物素化，将链霉亲和素与镧系络合物的双向螯合剂（BCPDA）偶联作为标记物，建立了广谱PAEs的TRFIA，与DMP、DEP、DBP、BBP、DNOP的交叉率分别为100%、110%、106%、104%、97%，与其他类似物的交叉率低于3.5%，可用于这5种PAEs塑化剂的同时分析检测，且交叉率相近，检测范围为0.5 pmol/mL～2 nmol/mL[19]。Tang等通过合成PAEs通用半抗原，免疫制备获得多克隆抗体，能够识别多种PAEs（包括DMP、DEP、DBP、DNOP、BBP、DEHP、DCHP），交叉反应率在63.9%～103.6%之间，IC50在17.12～102.57 ng/mL之间，最低检测限在0.012～0.042 ng/mL之间，检测到温室土壤样品中的PAEs浓度为1 260～3 580 ng/g，且使用10年的温室土壤比使用5年的能够检测出更高PAEs浓度[21]。PAEs多组分免疫分析检测技术的开发，为样品中多种PAEs同时存在提供了便捷的筛选手段，对于简化初筛程序、提高检测效率具有重要价值。
　　2.4 免疫亲和层析分析检测
　　免疫亲和层析分析技术是通过层析技术将免疫分析技术展示出来，便于更直观、更便捷地分析待测物质，可以实现定性和半定量检测。关于PAEs免疫分析主要是前文提到的方法，没有采用免疫亲和层析技术对其进行研究的报道，但在实际应用中，研究人员采用免疫亲和层析技术开发PAEs检测卡，也有多家生化试剂公司生产和销售PAEs类塑化剂检测卡。
　　3 PAEs免疫检测装置及应用
　　PAEs免疫检测装置主要是免疫检测试剂盒和检测卡，这2种装置分别以ELISA、胶体金免疫亲和层析为核心技术，在此基础上进行产品化，形成可用于生产实际中PAEs污染检测的产品。当前，国内外已有多个生化试剂公司生产和销售PAEs类试剂盒和检测卡。如国内的北京勤邦生物技术有限公司可以提供用于白酒样本中DBP、DIBP检测的ELISA试剂盒、化学发光试剂盒和检测卡，其中ELISA试剂盒的灵敏度为10 ng/mL，样品检测限为100 ng/mL，检测回收率稳定，变异系数小于10%。北京普赞生物技术有限公司的DBP检测试剂盒的灵敏度达30 ng/mL，样品回收率为（95±20）%，变异系数、交叉率均低于10%，可用于定性、定量检测饮用水、饮料、酒等样品中的DBP。美国REAGEN公司的DBP试剂盒检测灵敏度为50 ng/mL，回收率为70%～130%。美国GTX公司的DEHP试剂盒检测限达100 ng/mL，适用于肌肉和肝脏组织、尿样、血清、饲料中DEHP的检测。在检测装置的应用方面，也有相关报道，曹必溥等将北京普赞生物技术有限公司生产的塑化剂ELISA检测试剂盒应用于红酒中DBP的快速检测，并用GC-MS法对检测结果进行比较研究，结果表明，试剂盒能够满足对DBP的初筛要求，且样品前处理简单、检测快速、特异性高[42]。PAEs检测试剂盒和检测卡的生产和供应，可为环境和食品安全检测提供便捷快速的保障。
　　4 PAEs免疫快速检测技术的发展趋势
　　PAEs免疫快速检测技术作为一种简便快速的技术手段，在前期抗原抗体制备和免疫分析方法开发的基础上形成常见PAEs塑化剂检测的技术储备，并且重点部分种类已经有检测试剂盒和检测卡产品储备和商品化。这一系列PAEs免疫分析技术的开发可以为仪器分析检测提供替代和补充方法。由于这些免疫分析技术本身性能的差异和独特优势能够满足不同检测场所和检测需求，消费者在实际应用时可以灵活选择。然而，目前尚未有关于多种PAEs免疫快速分析方面的研究报道，有必要将此不足补充完善作为重要技术储备。此外，鉴于环境和食品中PAEs广泛存在、暴露风险大、超痕量水平样品难以准确检测，对免疫分析检测的质量要求也更加严格。免疫分析检测能否获得更高的灵敏度和特异性，以及更加简便快捷的操作，作为核心试剂的抗体起着关键作用。然而，用传统经典方法从动物体内获得的抗体，其质量和性状难以改变和提高。因此，加强PAEs抗体和免疫分析方法的研究，特别是应用新技术新方法制备高灵敏度、高特异性、多功能的抗体，对于推动免疫快速分析技术更多更广地应用于PAEs分析检测中具有重要意义。当前的免疫快速检测装置主要是试剂盒和检测卡，前期研究中灵敏度更为显著的荧光免疫分析和PCR免疫分析技术，以及更加便捷高效的均相免疫分析技术应该更好地将其产品化并加以推广应用，以便进一步完善免疫快速检测体系，更好地保护环境和食品安全，保障消费者健康。 　　参考文献：
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