喉鳞癌组织中CBLL1蛋白表达变化及意义
来源:用户上传
作者:
摘要：目的 分析喉鱗状细胞癌组织中E3泛素连接酶CBLL1的表达及其临床意义。方法 选取2017年9月～2019年7月我院60例喉鳞状细胞癌石蜡组织切片及对应30例癌旁石蜡组织切片，采用免疫荧光法检测喉癌组织及癌旁组织中CBLL1蛋白的表达，比较喉癌组织和癌旁组织、不同性别、年龄、临床分期、淋巴结转移、组织分化程度及肿瘤分型患者中CBLL1蛋白的表达;另选取10例冰冻喉癌组织及对应癌旁组织，应用实时定量PCR方法检测CBLL1蛋白中mRNA的表达。结果 喉癌组织中CBLL1的表达高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）;不同年龄、性别、肿瘤分型及组织分化程度的患者喉癌组织中CBLL1蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;不同临床分期、淋巴结转移的患者喉癌组织中CBLL1蛋白表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）;喉癌组织中CBLL1蛋白mRNA的相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 喉癌组织中CBLL1蛋白表达异常与喉鳞状细胞癌的发生、发展、侵润及转移密切相关，其可能作为喉癌未来治疗的新靶点。
关键词：E3泛素连接酶CBLL1;喉鳞状细胞癌;免疫荧光;RT-PCR
中图分类号：R739.65 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.002
文章编号：1006-1959（2020）05-0005-04
Abstract：Objective To analyze the expression of E3 ubiquitin ligase CBLL1 in laryngeal squamous cell carcinoma and its clinical significance. Methods From September 2017 to July 2019， 60 paraffin sections of laryngeal squamous cell carcinoma in our hospital and 30 paraffin sections adjacent to cancer were selected to detect the expression of CBLL1 protein in laryngeal cancer tissue and adjacent tissues by immunofluorescence. Compare the expression of CBLL1 protein in laryngeal cancer tissues and adjacent tissues， different genders， ages， clinical stages， lymph node metastasis， tissue differentiation， and tumor typing; another 10 frozen throat tissues and corresponding adjacent tissues were selected and applied in real time quantitative PCR was used to detect mRNA expression in CBLL1 protein.Results The expression of CBLL1 in laryngeal cancer tissues was higher than that in adjacent tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）. Comparison of CBLL1 protein expression in laryngeal cancer tissues of patients with different age， gender， tumor classification and degree of tissue differentiation， there was no significant difference （P>0.05）; The expression of CBLL1 protein in laryngeal cancer tissues of patients with different clinical stages and lymph node metastasis was statistically significant （P<0.05）; the relative expression of CBLL1 protein mRNA in laryngeal cancer tissues was higher than that in adjacent tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion The abnormal expression of CBLL1 protein in laryngeal cancer tissues is closely related to the occurrence， development， invasion and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma， which may be a new target for the future treatment of laryngeal cancer. Key words：E3 ubiquitin ligase CBLL1;Laryngeal squamous cell carcinoma;Immunofluorescence;RT-PCR
喉癌（laryngeal cancer）是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，占耳鼻咽喉部位恶性肿瘤的7.9%，头颈部恶性肿瘤的第3位[1]。目前，喉癌的治疗方式包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及生物治疗。近年来多种治疗方式不断改进，使得喉癌患者的喉功能保存率及生存质量不断提高，但调查显示[2，3]，喉癌患者的生存率仍无明显改善。目前认为恶性肿瘤的发生是与内、外源因素失衡作用的结果，其中以原癌基因的激活和抑癌基因的失活最为重要，确定喉癌治疗新的基因靶点有着重要的临床意义。泛素（ubiquitin）是由76个氨基酸残基组成的序列高度保守的多肽，普遍存在于真核生物体内，主要参与蛋白质降解、内吞作用、转录调节、信号转导、跨膜蛋白的分选及转运等多个过程。Cbl proto-oncogene-like-1（CBLL1）是E3泛素连接酶的一种，在各种发育和疾病发挥重要的生物学功能。CBLL1与恶性肿瘤侵袭和转移相关，本研究主要探讨喉癌中CBLL1的表达，同时结合临床资料分析CBLL1在喉癌组织中的表达情况及其与喉癌发生、发展之间的关系，现报道如下。
1材料与方法
1.1标本来源 选取2017年9月～2019年7月就诊于锦州医科大学附属第一医院耳鼻喉科经手术病理学诊断为喉鳞状细胞癌患者的石蜡组织切片，共60例，对应癌旁组织30例，另选取10例冰冻喉癌及癌旁组织标本，所有患者术前均未行放化疗治疗。60例石蜡切片中，男56例，女4例，年龄45～81岁，平均年龄（65.03±8.53）岁，根据国际抗癌联盟（UICC）2017年第8版公布的TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期20例，Ⅲ期18例，Ⅳ期10例。喉癌分型：声门上型18例，声门型42例。分化程度：高分化27例，中分化22例，低分化11例，发生淋巴结转移者13例，无淋巴结转移者47例。10例冰冻喉癌及癌旁正常组织标本中，均为男性，年龄55～71岁，平均年龄（62.03±3.53）岁，根据国际抗癌联盟（UICC）2017年第8版公布的TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例。喉癌分型：声门上型3例，声门型7例。颈部淋巴结转移为1例，无淋巴结转移为9例。本研究经医院伦理委员会批准，患者均已签署知情同意书。
1.2主要实验试剂及仪器 兔抗人多克隆抗体anti-CBLL1（博奥森生物技术有限公司），羊抗兔二抗（Abcam公司），核酸提取试剂盒（AmoyDx公司），PCR引物购自上海生物工程有限公司，奥林巴斯荧光共聚焦显微照相机（Leica TCS sp5II，德国Leica公司），荧光定量PCR仪（qRP-PCR）（Quant Studio3 美国Thermo Fisher Scientific公司）。
1.3 CBLL1蛋白表达检测 应用免疫荧光染色方法检测CBLL1蛋白的表达：①切片常规脱腊至水;②将切片放入柠檬酸钠抗原修复液中，微波加热，室温冷却;蒸馏水冲洗3次，5 min/次，PBS中润洗3次，5 min/次;③滴加5%正常山羊血清，室温封闭60 min，吸去多余液体;④滴加稀释的一抗工作液兔抗人CBLL1，4℃避光湿盒过夜;⑤滴加荧光素标记二抗，37℃湿盒孵育1 h，用PBS冲洗3次;⑥滴加抗荧光淬灭封片剂，37℃湿盒孵育5 min，用PBS冲洗3次，封片。以PBS为一抗做阴性对照。
1.4 CBLL1中mRNA表达检测 应用实时荧光定量PCR检测CBLL1中mRNA的表达：标本总RNA提取按照核酸提取试剂盒说明书进行，分光光度计检测总RNA在260 nm和280 nm处吸光值，OD260/OD280>1.8，可用于检测CBLL1 mRNA的表达。将提取总RNA逆转录转录合成第一链cDNA。以cDNA为模板进行扩增，引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：CBLL1上游引物为5'-GGAGTTGGATAGTAGAGGCGAGAG-3'，下游引物为5'-AACATCAAGACCACCCAAGGA-3'。以β-actin为内参基因，上游引物为5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物为5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。扩增条件为：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。反应条件为95 ℃预变性5 min后，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，总计40个循环。
1.5观察指标 比较喉癌组织及癌旁组织中CBLL1的表达情况和不同性别、年龄、临床分期、分化程度、淋巴结转移情况及肿瘤分型患者中CBLL1的表达情况;比较喉癌组织及癌旁组织中CBLL1 mRNA的相对表达量。CBLL1的表达情况利用IMAGE PRO PLUS 6.0图像分析系统进行图像分析，根据荧光显示的亮度，测定其平均荧光密度值，CBLL1 mRNA相对表达量采用2-△△CT法分析。
1.6统计学方法 采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示，行t检验，P<0.05差異具有统计学意义。
2结果
2.1喉癌组织及癌旁组织中CBLL1表达比较 喉癌组织及癌旁组织均有CBLL1的表达，见图1。喉癌组织CBLL1平均光密度值为（0.1810±0.0273），高于癌旁组织中的（0.0829±0.0268），差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2不同临床特征患者中CBLL1的表达比较 不同年龄、性别、肿瘤分型及组织分化程度的患者喉癌组织中CBLL1蛋白表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）;不同临床分期、淋巴结转移的患者喉癌组织中CBLL1蛋白表达比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。 2.3喉癌组织及癌旁组织中CBLL1 mRNA的相对表达量比较 10例喉癌组织及对应癌旁正常组织实时荧光PCR分析显示，癌旁组织中CBLL1的mRNA相对表达量为（1.0000±0.0000），低于喉癌组织中的（1.7335±0.2899），差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
3讨论
泛素化作为一种重要的蛋白翻译后修饰，参与了包括细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复、转录调控、自噬作用等多个重要胞内反应，对于细胞更新胞内蛋白、清除衰老蛋白、维持胞内环境稳定具有重要意义[4]。泛素连接酶E3能够特异性识别底物，是泛素- 蛋白酶体系中最重要的组成部分，约600多个不同的泛素连接酶在人体中调节多种靶蛋白[5]。CBLL1是E3泛素连接酶一种，被确定为第一个E-钙粘蛋白稳定性的翻译后调节子[6]。既往研究表明，CBLL1在多种肿瘤中起作用，如CBLL1在结肠癌组织中高表达，并参与肿瘤的发生及发展;在胃癌组织中表达上调，CBLL1过表达促进MDCK细胞生长[7];在非小细胞肺癌中CBLL1呈高表达，并促进细胞增殖和侵袭[8]。本研究以CBLL1为研究对象，观察其在喉鳞状细胞癌组织中的表达情况。
E-钙粘蛋白是经典的钙粘蛋白，主要介导同种细胞间的黏附反应，是维持上皮细胞形态和结构的完整性和极性的重要蛋白。研究表明E-钙粘蛋白的缺失与喉癌预后不良相关[9]，E3泛素连接酶CBLL1与E-钙粘蛋白结合，再将酪氨酸激酶v-src酪氨酸磷酸化的E-cadherin进一步泛素化，将其降解，从而调节癌细胞的侵袭及转移。由于CBLL1介导E-cadherin复合体的泛素化和内吞作用，CBLL1在上皮细胞中的表达增强E-cadherin的内吞作用，从而调节细胞与细胞粘附作用[10]。Figueroa A等[7]研究表明，CBLL1以E-钙粘蛋白下调独立的方式调节细胞增殖。Gong EY等[11]研究表明，CBLL1可以作为乳腺癌细胞中的转录调控因子，提示其在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。这些发现均表明CBLL1在E-钙粘着蛋白依赖性和非依赖性肿瘤发生中的作用。本研究结果显示，CBLL1在喉鳞状细胞癌中表达高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。说明CBLL1可能参与了喉癌的发生，另外CBLL1在Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织中表达高于Ⅰ～Ⅱ期，说明随着肿瘤的发展，CBLL1的表达逐渐增高，提示CBLL1可能参与了喉癌的发展。
肿瘤细胞发生侵袭和转移至少有黏附、降解、移动三个步骤，因此细胞间黏附作用的减弱是肿瘤细胞发生侵袭和转移的条件。E-钙粘蛋白的表达下降使得细胞间黏附作用下降，肿瘤细胞更容易脱离原组织而发生转移，表明喉癌的侵袭和转移与E-钙粘蛋白相关。本研究结果显示，淋巴结转移的患者喉癌组织中CBLL1表达高于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。表明CBLL1可能参与了喉癌的浸润与转移，CBLL1在喉癌中的表达上调，可能与临床分期、淋巴结转移相关。在喉癌中也可能存在CBLL1通过一系列泛素化下调E-钙粘蛋白的表达，从而促进了喉癌的侵袭和转移，但其机制需进一步研究。病理学分级是喉癌的恶性程度的指标，分化程度越低，喉癌的恶性程度越高，但本研究结果显示，CBLL1在不同分化程度的喉癌组织中表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），其具体机制有待进一步研究。
目前，CBLL1在癌症和其他疾病中的重要性正逐步被认识，CBLL1在不同的生理或病理条件可以有不同的功能，因此不同的信号通路对CBLL1的影响以及研究其作为癌症治疗靶点的临床潜在有用性同样重要。目前，以泛素化为靶点的肿瘤治疗已初有成效。比起传统的抗肿瘤药物，泛素化组分抑制剂在识别底物上具有特异性，可有效减少非特异性副作用的产生，也可有效减少癌细胞对传统抗肿瘤药物的耐药性[12]。本研究证实了CBLL1的表达与喉鳞状细胞癌的发生发展密切相关，期待后续相关研究能为该病的治疗提供参考依据。
综上所述， CBLL1在喉癌的发生、发展中起重要作用，随着喉鳞状细胞癌的进展，其表达随之增高，因此CBLL1可能作为喉癌治疗的新靶点。
参考文献：
[1]陈文杰，王斌全，高伟，等.喉癌流行病学特征及影响因素分析[J].中国当代医药，2015，22（12）：43-46.
[2]Macneil SD，Liu K.Secular trends in the survival of patients with laryngeal carcinoma，1995-2007[J].Curr Oncol，2015，22（2）：e85-e99.
[3]Van Dijk BA，Karim-Kos HE.Progress against laryngeal cancer in The Netherlands between 1989 and 2010[J].Int J Cancer，2014，134（3）：674-681.
[4]方帅，赵博.泛素化及相关疾病研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2017，44（5）：377-384.
[5]Hammel M，Kuhlman B，Qiu Y，et al.Mechanism of ubiquitin ligation and lysine prioritization by a HECT E3[J]. Elife，2013，2（15）：e00828.
[6]Shrestha H，Ryu T，Seo YW，et al.Hakai，an E3-ligase for E-cadherin，stabilizesδ-catenin through Src kinase[J].Cellular Signalling，2017（31）：135-145.
[7]Figueroa A，Kotani H，Toda Y，et al.Novel Roles of Hakai in Cell Proliferation and Oncogenesis[J].Molecular Biology of the Cell，2009，20（15）：3533-3542.
[8]Hui L，Zhang S，Wudu M，et al.CBLL1 is highly expressed in non-small cell lung cancer and promotes cell proliferation and invasion[J].Thoracic Cancer，2019，10（6）：1479-1488.
[9]张穆，刘君.E-cadherin、α-catenin与肿瘤研究进展[J].泰山医学院学报，2018，39（10）：1195-1198.
[10]Castosa R，Martinez-Iglesias O，Roca-Lema D，et al.Hakai overexpression effectively induces tumour progression and metastasis in vivo[J].Scientific Reports，2018，8（1）：3466.
[11]Gong EY，Park E，Lee K.Hakai acts as a coregulator of estrogen receptor alpha in breast cancer cells[J].Cancer Science，2010， 101（9）：2019-2025.
[12]王佳悅，赵博.泛素化在肿瘤治疗方面的应用及展望[J].生命的化学，2017，37（6）：879-887.
收稿日期：2020-01-01;修回日期：2020-01-10
编辑/成森
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15194097.htm
