猪流行性腹泻病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

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　　摘要 为建立检测猪血清中猪流行性腹泻病毒（PEDV）IgG抗体的间接ELISA方法，以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒为包被抗原，采用方阵滴定法优化反应条件，建立了2种检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法。结果显示，纯化全病毒和重组N蛋白抗原的最佳包被浓度分别为1.00和4.92 μg/mL，检测样品最佳稀释度分别为1∶100和1∶50，重复性试验的变异系数均小于10%，PEDV阳性血清的最低检测稀释倍数分别为1∶1 600和1∶800，对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒等阳性血清均无交叉反应性，2种方法对临床样品检测符合率为95.92%。这表明2种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性，可用于检测和评价血清中特异性PEDV IgG抗体。
　　关键词 猪流行性腹泻病毒;IgG抗体;间接ELISA
　　中图分类号 S852.65+1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）19-0103-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.026
　　Abstract In order to establish indirect enzymelinked immunosorbent assy（iELISA） for detecting specific IgG antibody level against porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in pig’s serum， the two indirect ELISA methods were established with the purified PEDV and recombinant N protein of PEDV as coating antigen. The results showed that the optimal coating antigen concentrations were 1.00 and 4.92 μg/mL respectively， and the optimal dilutions of sample were 1∶100 and 1∶50 respectively. The coefficients of variation of the intraand interbatch repetitive tests were all less than 10%， the minimum dilution ratio of PEDV positive sample were 1∶1 600 and 1∶800 respectively. The two indirect ELISA methods had no crossreaction with those positive sera of transmissible gastroenteritis virus，porcine pseudorabies virus，and so on. The coincidence rate of the two indirect ELISA methods was 95.92%. The results suggested that the two indirect ELISA methods were specific， sensitive， and repeatable. They could be used to detect and evaluate the IgG antibody against PEDV in pig’s serum.
　　Key words Porcine epidemic diarrhea virus;IgG antibody;Indirect ELISA
　　基金項目 安徽省科技重点研发项目 （1704a07020066）;安徽省农业科学院平台项目（2020YL094）;安徽省生猪产业技术体系项目（AHCYTX-05-09）;安徽省科技重大专项（17030701008）。
　　作者简介 芮聪杰（1989—），男，河南漯河人，硕士，从事畜禽传染病研究。*通信作者，副研究员，博士，从事畜禽传染病研究。
　　收稿日期 2020-03-10
　　猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种以水样腹泻、脱水、呕吐为主要特征的急性、高度接触性肠道传染病，各个品种和各个年龄阶段的猪均易感，尤其对刚出生至10日龄以内的哺乳仔猪影响最为严重，表现为高病死率，病死率可高达100%[1-3] 。1971年首次在英国发现PED[4]，我国自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[5]，2010年底开始PED在中国、美国、墨西哥、日本、加拿大、哥伦比亚、韩国、乌克兰等国家和地区相继暴发猪流行性腹泻大流行疫情[6-7]，给我国及世界上众多国家的生猪养殖造成巨大的经济损失。自2014以来，虽然猪流行性腹泻疫情在我国一直比较平稳，但由于疫苗免疫对猪流行性腹泻的控制成效并不显著，免疫猪场的发病哺乳仔猪仍呈现高发病率和高病死率，猪流行性腹泻病目前在我国呈常态化，仍是严重危害养猪生产的重要疫病之一[8]。猪流行性腹泻的早期诊断和猪群抗体水平的检测，对该病的预防与控制起着关键性作用。ELISA 检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应快速、操作相对简单以及可对血清进行批量检测等特点，因而在人和动物疫病的血清学抗体检测中应用广泛。笔者以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒为包被抗原，分别建立了检测血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法，旨在为有效开展PED防控提供依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　PEDV纯化全病毒、PEDV 重组N蛋白、PEDV阴性血清及PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清样品由畜禽产品安全工程安徽省重点实验室制备保存;四甲基联苯胺（TMB）购于索莱宝生物科技有限公司;山羊抗猪IgG-HRP购于Abcam公司;Tween-20购于德国Bio froxx公司;牛血清白蛋白（BSA）购于美国Sigma公司;96孔ELISA包被板购于Corning公司。
　　1.2 间接ELISA方法的建立及优化
　　采用方阵滴定法，确定间接ELISA的PEDV N蛋白及纯化全病毒2种抗原的最佳包被浓度（0.50～9.84 μg/mL），包被液[0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6）]，抗原包被条件（37 ℃孵育2 h后4 ℃ 16 h、4 ℃ 16 h、37 ℃孵育2 h），封闭液的选择[1%BSA、5%BSA、5%脱脂奶粉（SMP）]，待检血清样品的稀释浓度（1∶50～1∶800），待检血清样品的反应时间（15～90 min），山羊抗猪IgG-HRP稀释浓度（1∶500～1∶10 000），山羊抗猪IgG-HRP作用时间（15～90 min），TMB显色时间（5～20 min）。
　　1.3 临界值的确定
　　按以PEDV N蛋白及纯化全病毒为包被抗原建立的2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，对44份PEDV IgG抗体阴性血清样品进行检测，每份样品做2个重复孔，计算出所检测阴性样品OD450 nm值的平均值（）和标准差（SD）。样品OD450 nm值≥+3×SD为阳性;样品OD450 nm值≤+2×SD为阴性;样品OD450 nm值介于二者之间为可疑。
　　1.4 敏感性试验
　　将PEDV抗体为阳性的血清样品倍比稀释，按照已建立的2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，测定OD450 nm值，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性，确定2种方法的最低检测稀释度。
　　1.5 特异性试验
　　按已建立的2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，对畜禽产品安全工程安徽省重点实验室制备的TGEV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV阳性血清样品进行检测，设立PEDV阳性和阴性血清对照，测定OD450 nm值，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性，评估2种方法的特异性。
　　1.6 重复性试验
　　选取4份阳性血清样品及1份阴性血清样品，每份样品做4个重复，按照已建立的2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，使用同一批次PEDV N蛋白和浓缩纯化的全病毒抗原，包被同一批次的酶标板，进行批内重复试验，另外包被不同批次的酶标板，进行批间重复试验。
　　1.7 临床样品检测
　　按照已建立的2种IgG抗体间接ELISA检测方法操作，对采自安徽地区的6家开展PEDV免疫猪场的共245份猪血清样品进行检测，测定OD450 nm值，根据阴阳性临界值，判断其阴阳性。
　　2 结果与分析
　　2.1 间接ELISA方法的建立及反应条件确定
　　经测定该试验保存的浓缩纯化PEDV全病毒和重组N蛋白浓度分别为3.95和1.23 mg/mL，以其为包被抗原，分别建立检测PEDV IgG抗体的间接ELISA检测方法。采用方阵滴定法，确定了最佳反应条件（表1）。
　　2.2 阴阳性临界值的确定
　　用该试验建立的2种间接ELISA方法分别检测44份阴性血清样品，结果显示以PEDV全病毒作为包被抗原，当样品OD450 nm≥0.440时判定为阳性，当样品OD450 nm≤0.365时判定为阴性，当样品OD450 nm介于二者之间时判为可疑;以重组N蛋白为包被抗原，当样品OD450 nm≥0.434时判定为阳性，当OD450 nm≤0.355时判定为阴性，当样品OD450 nm介于二者之间时判为可疑。
　　2.3 特异性试验
　　用该试验建立的2种间接ELISA方法在相同的反应条件下，分别对TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性血清样品进行检测，并设置PEDV阴阳性血清样品作为对照，结果显示，除阳性血清样品外，其余样品结果均呈阴性（表2），表明该试验建立的2种间接ELISA方法均具有较好的特异性。
　　2.4 敏感性试验
　　对该试验建立的2种间接ELISA方法进行敏感性检测，结果显示（图1），以PEDV全病毒作為包被抗原，当阳性血清样品稀释到1∶1 600时仍可检测为阳性（OD450 nm=0.497）;以PEDV重组N蛋白为包被抗原，当阳性血清样品稀释到1∶800时仍可检测为阳性（OD450 nm=0.478）。这说明建立的2种间接ELISA方法均具有良好的敏感性。
　　2.5 重复性试验
　　由表3可知，2种间接ELISA方法的批内和批间变异系数均为2.50%～8.23%，变异系数均小于10%，表明该试验建立的2种间接ELISA方法均具有良好的可重复性。
　　2.6 临床样品的检测
　　用该试验建立的2种间接ELISA方法，分别检测245份来自5家猪场的血清样品，结果显示以PEDV全病毒作为包被抗原，检测样本的阳性率为81.22%（199/245）;以重组N蛋白为包被抗原，检测样本的阳性率为79.59%（195/245）。这2种方法的检测符合率为95.92%（235/245）。
　　3 讨论
　　核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白是PEDV4种主要结构蛋白之一，研究表明其在病毒的复制以及诱导特异性免疫反应上发挥重要的作用，在感染早期能够诱导集体产生针对N蛋白的高水平抗体，因而利用N 蛋白建立PEDV 诊断技术具有很好的应用前景[9-12]，试验所用PEDV重组N蛋白为畜禽产品安全工程安徽省重点实验室制备，且已证实其与PEDV阳性血清有良好的反应特异性[13]。病毒上诱导动物机体产生抗体的表位为B淋巴细胞表位，是构象表位，PEDV 的重组表达蛋白，不论是原核或真核表达的蛋白，虽然氨基酸序列相同，但由于其空间构象可能不同，重组表达蛋白上所包含的B淋巴细胞表位，其所诱导产生的抗体，可能与病毒感染所诱导产生的抗体存在不同或不完全相同。PEDV的全病毒，由于病毒蛋白为天然构象，因而保留其全部的抗原表位，也使得以其为包被抗原建立的抗体检测ELISA方法，临床上检测特异性更强，阳性检出率更高[14]。 　　该试验以纯化的PEDV全病毒和重组N蛋白抗原作为包被抗原，分别建立了检测猪血清中IgG抗体的间接ELISA方法，其阳性样品检测的最低稀释度分别为1∶1 600和1∶800，批内和批间变异系数均小于10%（2.50%～8.23%），与TGEV、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV阳性样品无交叉反应，说明该试验建立的2种检测PEDV IgG抗体的间接ELISA方法均具有良好的敏感性、重复性和特异性，均可用于检测和评估血清中PEDV感染和免疫产生的IgG抗体水平。虽然以PEDV全病毒为包被抗原的阳性检出率（81.22%）略高于重组N蛋白（79.59%），但差异不显著，且2种方法对临床样品的检测符合率较高（95.92%），因此可根据实际情况选择应用。
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