１１个平菇菌株酯酶同工酶的研究

来源:用户上传      作者: 李　红　苏君伟　张　敏　刘　娜　孔全彧

　　平菇在分类学上隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、侧耳属。平菇适应性强，出菇温度范围广，栽培相对简易，产量高，肉质肥嫩，营养丰富，市场容量大，是我国20年来发展最快的食用菌之一。
　　多年来，大型真菌的分类多以子实体形态特征为主要依据，平菇近缘种之间的区分也是如此。众所周知，平菇子实体形态特征易受温度、光照、通风和培养基等外界环境条件的影响，完全靠子实体形态对平菇近缘种物种进行鉴定有时是困难的，对种内不同特点和性状的菌株的区别就更加困难。1980年以来，同工酶电泳技术被广泛应用于各种食用菌的鉴别和遗传多样性研究。同工酶作为基因编码的产物，由于模板作用，酶蛋白质中多肽链上的氨基酸顺序(通过RNA)直接反应了DNA链上碱基对的顺序，其变化能代表DNA分子水平上的变化。因此，同工酶分析成为从蛋白质分子水平上研究生物群体遗传分化的重要手段之一。本研究的目的在于探索相对简单、易于应用、效果稳定、环保安全的方法，对辽宁省主栽的平菇菌株进行鉴定区别，并对其亲缘关系进行聚类分析，为遗传学研究和育种提供依据。
　　
　　一、材料和方法
　　
　　1．试验材料
　　(1)菌种
　　P-1、P-2、P-3、P-4、P-6、P-11由辽宁省农科院食用菌研究所提供，P-5、P-8、P-9、P-10引自江都天达食用菌研究所；
　　P-7引自沈阳农业大学食用菌研究所。
　　(2)培养基
　　PDA培养基：土豆200 g，琼脂20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钾3 g，蒸馏水1000 mL。
　　
　　2．主要试剂
　　分离胶缓冲液(pH 8.9)，分离胶贮液，过硫酸铵溶液，浓缩胶缓冲液(pH 6.7)。浓缩胶贮液；四甲基乙二胺；电极缓冲液Tris－Gly；酯酶染色液。
　　
　　3．试验方法
　　(1)样品的制备
　　将供试菌株在PDA斜面上活化后，转接到加富培养基斜面上，25℃下培养14 d后，将长满培养基表面的菌丝小心地用刀片刮下，清水清洗3次，置吸水纸上吸去多余水分。称重0.5 g后移至小离心管内(1.0 mL)，置－20℃冰箱内冷冻24 h，加入等量研磨液和少量石英砂后冰浴下研磨成匀浆，离心20 min(4℃，10 000 r/min)。取上清液为样品，冰箱内低温保存备用。
　　(2)电泳
　　采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。将样品提取液加入等量的40％蔗糖溶液混合后点样，每点加样40μL，电泳指示剂为溴酚兰，初始电压为200 V／板，进入分离胶后加大电压为250 V／板。当溴酚兰指示剂迁移至距离末端1 cm左右时，停止电泳。
　　(3)染色
　　电泳结束后取下胶板，入染色液中25℃下染色30 min，待显示出桃红色或褐色的清晰酶带后取出，用蒸馏水漂洗数次，用7％～10％的醋酸固定，4℃保存。
　　
　　二、结果与分析
　　
　　1．酯酶同工酶谱带
　　11个平菇品种菌丝体酯酶同工酶在酯酶图谱上表现不同，电泳图谱见图1。
　　
　　整个试验共检测出20条酶带，多数菌株间酶带数目不同，分别为7～13条，多为7～10条。其中Rf(相对迁移率)0.22、0.62为9个菌株所共有，可以认为是平菇的基础酶谱带。大部分菌株种间和种内酶带差异较大，多态性较强。P-4、P-5号酶带基本相同，表明菌株间遗传差异较小。
　　酯酶同工酶相对迁移率(Rf)又叫相对泳动率，用它来表示分离区带的泳动速度，酶带不同，迁移率亦不同。
　　Rf=d2／d1式中，d1：溴酚兰迁移的距离，d2：蛋白质迁移的距离。
　　11个平菇品种菌丝体酯酶同工酶，在酶谱类型上表现有差异，表明其菌株酯酶同工酶酶带相对迁移率也不同。
　　
　　2．平菇品种间联合系数(s)
　　由相对迁移率可以看出各品种间亲缘关系的相似性，但还不够直接。根据Sneath和Sokal 1973年提出的联合系数(S)，可以更清楚地反映各品种间的亲缘关系(见表1)。
　　S=c／(a+b-c)式中，a：A菌株酶带数；b：B菌株酶带数； c：A、B菌株共有酶带数。
　　由表1可以看出，联合系数(S)在0～1之间变化，其值越大，两品种亲缘关系越近，越小亲缘关系越远。其中，P-4和P-5联合系数＝1，说明二者亲缘关系非常近，P-2和P－8联合系数=0.133，亲缘关系较远。
　　
　　3．酯酶同工酶聚类分析
　　利用DPS数值处理系统软件对所得的酶带进行聚类系统分析，聚类分析树状图见图2。结果显示，在相似水平为0.25时可将供试菌株分为4类：第一类包括P-1、P-6、P-8、P-3，第2类包括P-2、P-10、P-7、P-11，第3类包括P-9。第4类包括P-4、P-5。聚类分析结果与形态特征基本趋同。
　　
　　三、结论与讨论
　　
　　结果显示，11个平菇菌株共检测出20种酶带类型，表明平菇的酯酶同工酶酶谱分布呈多态性。利用DPS数值处理系统软件进行聚类分析，树状图反映出11个菌株被分为四大类，类间和类内菌株遗传变异程度不同，但总体上遗传变异并不丰富。采用酯酶同工酶分析技术对平菇不同栽培菌株进行鉴定，可以准确地反映出平菇不同菌株间的亲缘关系和遗传分化程度。
　　同工酶技术在许多学科中得到了广泛的重视和应用。关于同工酶在大型真菌分类鉴定中的应用已有许多报道，该技术成为菌株分类鉴定的重要手段的同时，也作为亲缘关系研究的一种途径。酯酶同工酶在食用菌个体内具有较高的相对稳定性，可作为食用菌种质资源研究最有效的生化指标之一。酶谱资料可以作为鉴定物种、研究分类、进化与变异的重要指标。
　　但同工酶技术也具有易受到培养时间、培养基配方及培养温度等影响而表现出不一致性的缺点。为了更加深入的揭示菌株间的遗传聚类关系，笔者认为传统形态学分类有必要结合同工酶技术等现代生物学分类的优点，进行有益的补充，以使其分类结果能更客观的反映菌株间的本质联系与区别。

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