免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌的效果观察
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【摘要】 目的 探讨免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌的效果。方法 47例鼻咽癌患者作为研究对象， 进行免疫组化和原位杂交双标记技术检测鼻咽癌细胞中 EB 病毒的表达情况， 观察检测效果。结果 免疫组化检测结果显示， 广谱细胞角蛋白（CK）定位于细胞浆内。原位杂交双标记技术检测结果显示， EB病毒编码的小 RNA（EBER）阳性反应定位于鼻咽癌细胞的细胞核上。免疫组化检测后的阳性细胞的胞膜表现为红色， 原位杂交双标记技术检测后的阳性细胞核表现为蓝黑色， 而双阳性细胞的核与膜呈现蓝红色， 不仅对比鲜明同时背景十分清楚， 双染成功后细胞及组织结构表现完整。结论 免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌均有一定作用， 但原位杂交双标记技术检测比免疫组化方法更灵敏， 值得临床推广应用。
【关键词】 鼻咽癌;病理诊断;原位杂交双标记技术;免疫组化
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.11.012
鼻咽癌是一种在我国南方地区发病率非常高的恶性肿瘤， 由于缺乏特异性的诊断方法， 患者往往预后较差[1]。鼻咽癌又分为角化性鳞状细胞癌、非角化性癌以及基底样鳞状细胞癌， 其中未分化型的非角化性癌是最常见的。目前手术切除以及术后放化疗治疗对于提高患者的生存率有很好的作用， 都属于不可缺少的治疗手段[2]。鼻咽癌活检病理诊断应用较多的指标是CK免疫组化染色， 可能对鼻咽癌的诊断具有重要意义。免疫组化检测与原位杂交双标记技术检测， 可同时分析CK与EBER两种指标在鼻咽癌细胞中的表达情况， 免疫组化这种传统的检测方法有助于鼻咽癌的病理诊断[3]。本文主要探讨免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌的效果， 为促进鼻咽癌的诊断提供合理的参考， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择2004年1月～2018年1月来本院进行治疗的47例鼻咽癌患者作为此次研究对象， 其中男27例、女20例。47例鼻咽癌患者均经病理学诊断。组织经 4%中性甲醛固定并用常规石蜡包埋， 切片厚3.5 μm左右。
1. 2 试剂及方法
1. 2. 1 试剂 EGFR基因检测试剂盒[国食药监械（准）字2013第3402095号]， 包括蛋白酶K， FITC标记的EBER探针（福建泰普生物科学有限公司）， 碱性磷酸酶标记的抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体（重庆沒涛生物科学有限公司）， 及BCIP/NBT显色液等（江西仙岩生物科学有限公司）;EBER原位杂交试剂盒[国食药监械（准）字2012第3400329号]：包括蛋白酶K（福建泰普生物科学有限公司）， 地高辛标记的EBER探针（江西仙岩生物科学有限公司）， 抗地高辛一抗及二氨基联苯胺（DAB）显色液（福建泰普生物科学有限公司）等;广谱CK， 免疫组化超敏SAP染色试剂盒（江西仙岩生物科学有限公司）， 快红和3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）显色剂（江西仙岩生物科学有限公司）等;进口分装Dako公司的Envision免疫组化检测试剂。
1. 2. 2 方法
1. 2. 2. 1 原位杂交双标记技术检测步骤 ①切片常规脱蜡至水裱贴于经防脱处理的洁净载玻片上;②滴加100 μl蛋白酶K液， 无水酒精脱水后进行干燥处理;③组织上滴加20 μl探针杂交液， 加上盖玻片;④37℃下孵育3 h取出切片;⑤用含0.1%v/v TritonX-100的Tris缓冲盐溶液冲洗;⑥室温孵育10 min， 甩干;⑦加入兔抗FITC/抗核周因子（APF）（ab’）室温孵育30 min;⑧Tris缓冲盐溶液冲洗5 min;⑨加入BCIP/NBT显色液4℃孵育过夜， 苏木精复染， 脱水、透明、封固。观察检测效果。
1. 2. 2. 2 免疫组化具体步骤 ①免疫组化挑选显色后阳性表达的切片;②置入pH值为8.0的Tris-EDTA缓冲液中高压修复90 s;③磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗， 然后用10%羊血清封闭孵育10 min;④PBS冲洗后滴加广谱CK一抗100 μl， 稀释度为1∶200;⑤PBS冲洗后滴加Envision二抗;⑥DAB显色， 显微镜下仔细观察显色情况合适时中止显色;⑦脱水、透明、封固。观察检测效果。
2 结果
免疫组化检测结果显示， 广谱CK定位于细胞浆内。原位杂交双标记技术检测结果显示， EBER阳性反应定位于鼻咽癌细胞的细胞核上。免疫组化检测后的阳性细胞的胞膜表现为红色， 原位杂交双标记技术检测后的阳性细胞核表现为蓝黑色， 而双阳性细胞的核与膜呈现蓝红色， 不仅对比鲜明同时背景十分清楚， 双染成功后细胞及组织结构表现完整。
3 讨论
鼻咽癌是我国常见癌症类型之一， 其中鼻咽癌又分为角化性鳞状细胞癌、非角化性癌以及基底样鳞状细胞癌。有学者指出鼻咽癌发病率为鼻咽部恶性肿瘤之首[4， 5]。现目前的鼻咽癌的诊断方法缺乏灵敏度与特异性， 但最近又研究发现 EB 病毒感染与鼻咽癌密切相关， 可能对鼻咽癌的诊断具有重要意义[6]。广谱CK（AE1/AE3）染色是现目前鼻咽癌诊断中运用得最为广泛的一个免疫组化指标， 因为鼻咽癌细胞 CK 呈阳性表达而肉瘤和淋巴瘤细胞 CK 呈阴性， 所以诊断效果令人满意， 免疫组化这种传统的检测方法有助于鼻咽癌的病理诊断[7]。本次研究表明， 免疫组化检测结果显示， 广谱CK定位于细胞浆内。原位杂交双标记技术检测结果显示， EBER阳性反应定位于鼻咽癌细胞的细胞核上。免疫组化检测后的阳性细胞的胞膜表现为红色， 原位杂交双标记技术检测后的阳性细胞核表现为蓝黑色， 而双阳性细胞的核与膜呈现蓝红色， 不仅对比鲜明同时背景十分清楚， 双染成功后细胞及组织结构表现完整。本研究结果与相关报道一致[8]。此外， 也有研究表明通过免疫组化检测来帮助诊断鼻咽癌， 具有操作方便、步骤简单的优势， 但无法检出EB病毒的定位及转录数量， 因此往往被作为EB病毒的初步筛查方法[9-11]。 综上所述， 免疫组化与原位杂交双标记技术检测EB病毒用于诊断鼻咽癌均有一定作用， 但原位杂交双标记技术检测比免疫组化方法更灵敏， 值得临床推广应用。
参考文献
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[收稿日期：2018-09-20]
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