肠炎灌肠液的质量标准研究

来源:用户上传      作者:罗群　蒲清荣　任桂林　李五生　黄锐

　　摘要：目的 研究建立肠炎灌肠液的质量标准，为生产质量提供保障。方法 采用薄层色谱法对肠炎灌肠液中白头翁、秦皮、黄连、木香、当归進行TLC鉴别;采用HPLC法测定肠炎灌肠液中盐酸小檗碱的含量。结果 薄层色谱斑点清晰、分离度效果较好、且阴性无干扰;HPLC法测定肠炎灌肠液中盐酸小檗碱的含量稳定、可靠，且阴性无干扰。结论 该方法准确可靠、专属性强、重现性好，可作为肠炎灌肠液质量控制的有效方法。
　　关键词：肠炎灌肠液;薄层色谱法;高效液相色谱法;盐酸小檗碱
　　中图分类号：R927.11 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）03-0079-04
　　肠炎灌肠液是是以白头翁汤为基础，反复优化而成，具有清热解毒，凉血止痢，行气止痛的功效，适用于湿热内蕴型结肠病，症见腹泻、腹痛、黏液血便、里急后重、便秘等。该方由白头翁、黄柏、酒黄连、秦皮、当归、木香等8味中药组成，具有多年临床使用经验，疗效确切。
　　方中君药白头翁能明显改善溃疡性胃肠炎的创面溃疡程度，能够缓解里急后重、腹痛等症状[1]。故对白头翁进行薄层鉴别。方中黄连的有效成分为小檗碱及黄连素，其主要药理作用有抗病原体、抗菌、抗腹泻、抗炎等[2];黄柏主要含有小檗碱、药根碱、木兰碱、黄柏碱等成分，其主要具有抗菌、抗溃疡、提高免疫力、降血糖、降压、抗氧化等药理作用[3]。黄连、黄柏均含有小檗碱成分，而盐酸小檗碱对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金葡菌、链球菌、伤寒杆菌及阿米巴原虫均有抑制作用[4]，且处方用量大，因此盐酸小檗碱含量直接关系到制剂的有效成分含量和药物治疗效果。故重点对该制剂中盐酸小檗碱的采用HPLC进行含量测定，并同时对秦皮、当归、木香、黄连药材进行薄层鉴别，以期能够全面掌握其质量控制标准。
　　1 仪器与材料
　　1.1 实验材料 盐酸小檗碱（批号：110713-201212）、白头翁对照药材（批号：121615-201302）、秦皮乙素（批号：110741-200506）、秦皮对照药材（批号：121415-200702）、木香对照药材（批号：120921-201309）、当归对照药材（批号：120927-201315）、黄柏对照药材（批号：121510-201105）、黄连对照药材（批号：120913-201310），均由中国食品药品检定研究院提供;去氢木香内酯（批号：MUST-11083101），由由成都曼思特生物科技有限公司提供;乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
　　1.2 实验仪器 LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）;SPD-20A紫外可见检测器LCsolution色谱工作站;UltimateTM C18键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;JPCT0328超声波提取器（武汉嘉鹏电子有限公司）;JA203H电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）;AUW120D电子天平（日本岛津）GOODLOOK-LOOK型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）;HH数显电热恒温水浴箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）。
　　2 方法与结果
　　2.1 TLC鉴别
　　2.1.1 肠炎灌肠液中白头翁的薄层色谱鉴别 取本品20 mL，用正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取白头翁对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为对照药材溶液。除白头翁外，其余药材按照肠炎灌肠液制备方法，制备方式同供试品溶液，作为阴性对照。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液3～4 μL，对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-醋酸-水（4：1：2）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰[5-6]，见图1。
　　图1 肠炎灌肠液白头翁薄层色谱图
　　1.白头翁对照药材;2～4.供试品;5.阴性样品
　　2.1.2 肠炎灌肠液中秦皮的薄层色谱鉴别 取本品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取秦皮对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。另取秦皮乙素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方（除秦皮药材外）与制法，制成阴性对照样品，其余处理同供试品溶液，作为阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：3：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品无干扰[7]，见图2。
　　图2 肠炎灌肠液秦皮薄层色谱图
　　（1.秦皮对照药材;2.秦皮乙素;3～5.供试品;6.阴性样品）
　　2.1.3 肠炎灌肠液中木香的薄层色谱鉴别 取本品50 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取木香对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。另取去氢木香内酯，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方（除木香药材外）与制法，制成阴性对照样品，其余处理同供试品溶液，作为阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮（10：3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰[8-9]，见图3。 　　图3 肠炎灌肠液木香薄层色谱图
　　（1.木香对照药材;2.去氢木香内酯;3～5.供试品;6.阴性样品）
　　2.1.4 肠炎灌肠液中当归的薄层色谱鉴别 取本品50 mL，用乙醚振摇提取3次，每次30 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5 g，加乙醚20 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方（除当归药材外）与制法，制成阴性对照样品，其余处理同供试品溶液，作为阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品无干扰[10～11]。
　　图4 肠炎灌肠液当归薄层色谱图
　　1.当归对照药材;2～4.供试品;6.阴性样品
　　2.1.5肠炎灌肠液中黄连的薄层色谱鉴别 本品摇匀后，取1 mL蒸至稠膏状，加甲醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.1 g，加甲醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。除黄连外，其余药材按照肠炎灌肠液制备方法，制备方式同供试品溶液，作为阴性对照。照薄层色谱法（中国药典2015版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨试液（12：6：3：3：1）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性样品（除去黄柏中盐酸小檗碱外）无干扰[12]。
　　图5 肠炎灌肠液黄连薄层色谱图
　　1.黄连对照药材;2～4供试品;5.阴性样品
　　2.2 含量测定
　　2.2.1 色谱条件与系统适用性试验[13] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.1%磷酸溶液（50：50）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）为流动相;检测波长为265 nm;柱温为40℃。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。
　　2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含盐酸小檗碱0.1 mg的溶液，即得。
　　2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品上层澄清液1 mL，置50 mL量瓶中，加流动相约40 mL，超声处理30 min，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
　　2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
　　2.2.5 样品测定 取肠炎灌肠液3批（批号：20161019、20161020、20161021），测定其含量。含量测定结果见表1，平均值为3.18 mg/mL，RSD为0.91%。
　　3 讨论
　　白头翁、秦皮、当归、木香的薄层鉴别均采用了阴性对照，结果所得色谱图清晰，分离良好，阴性对照均无干扰。结果表明，系统专属性强，色谱特征斑点清晰，分离良好，无拖尾现象，可用于肠炎灌肠液的定性鉴别标准。
　　本实验还对方中的黄柏、黄连分别采用不同展开剂进行TLC试验，因均含有盐酸小檗碱，且试验表明，黄柏无法排除黄连的干扰，专属性不强，故黄柏药材未列入薄层鉴别正文。但黄连除去黄柏中盐酸小檗碱干扰的1个黄色斑点外，还具有黄柏不具有的3个黄色主斑点，因此通过TLC试验鉴别黄连，使在黄连对照药材对应的色谱上显4个相同颜色的黄色荧光斑点，收入标准。
　　在对肠炎灌肠液中白头翁进行定性鉴别时，曾参照2015版《中国药典》第一部白头翁的鉴别方法制备供试品溶液：将肠炎灌肠液蒸干，加入甲醇后进行超声提取，滤过，即得，采用药典白头翁鉴别方法和文献[14～15]中的展开系统均不能得到理想的分离结果。实验结果均不理想，故调整实验方法，改用正丁醇作为提取溶剂，将肠炎灌肠液直接用正丁醇提取后，正丁醇液蒸干，加甲醇溶解作为供试品制备方法，所得实验结果斑点清晰，实现较好的分离效果。
　　参考文献：
　　[1]刘佃温，杨会举.消溃汤灌肠对湿热内蕴型溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜修复的影响[J].时珍国医国药，2016，27（7）：1561-1562.
　　[2]王维琪.黄连有效成分的药理研究与进展[J].中医临床研究，2016，8（6）：147-148.
　　[3]孙森凤，张颖颖，褚万春.黄柏药理作用的研究进展[J].山东化工，2017，46（14）：99-100.
　　[4]刘彦辰.盐酸小檗碱的抑菌抗炎作用机理研究[D].辽宁：辽宁中医药大学，2017.
　　[5]程洪兵，赵永旗，邵海荣，等.苦地黄洗剂定性定量检测方法研究[J].北京中医药，2018，37（6）：573-576.
　　[6]贾成友.白黄泄热止掏片的药学研究[D].四川：成都中医药大学，2016.
　　[7]陈媛，宋增炫.银丁灌肠剂质量标准[J].解放军药学学报，2015，31（2）：117-119.
　　[8]高永民，秦启亮.十味木香散质量标准研究[J].中国药业，2019，28（4）：18-21.
　　[9]王佳.古方乌发膏的药学研究[D].四川：成都中醫药大学，2017.
　　[10]初洪波，王健.归芎头痛颗粒制备工艺及质量标准研究[J].吉林中医药，2019，39（1）：98-101.
　　[11]荀艳，秦亚东.妇科十味片质量标准研究[J].现代中药研究与实践，2018，32（3）：45-48.
　　[12]王明华.肠可宁微丸质量标准研究[J].中国药业，2019，28（4）：28-30.
　　[13]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：305.
　　[14]程立方，闫雪生，郭威.肠安片质量控制研究[J].药学研究，2013，32（1）：7.
　　[15]郑友兰，董庆峰，鲍建才，等.肠泰合剂的薄层鉴别方法研究[J].中成药，2007，29（11）：1718-1720.
　　（收稿日期：2019-10-18）
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