IGF-1、mtDNA及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平在盆底器官脱垂患者组织表达研究
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【摘要】 目的：研究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、线粒体DNA（mtDNA）及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ在盆底器官脱垂（POP）患者的组织表达。方法：收集笔者所在医院POP患者50例作为研究组，同时选择同期行子宫切除术的良性非POP患者50例作为对照组。比较两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值，以及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。结果：研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值分别为（0.41±0.09）、（0.47±0.08）、（0.56±0.11），均低于对照组的（0.85±0.11）、（0.92±0.13）、（0.93±0.12），差异有统计学意义（P<0.05）。研究组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值分别为（3.36±0.12）、（5.44±0.18）、（5.16±0.13），均低于对照组的（4.49±0.14）、（7.17±0.19）、（6.87±0.15），差异有统计学意义（P<0.05）。结论：POP患者宫骶韧带-子宫主韧带的mtDNA、胶原蛋白ⅠmRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均为下调趋势，可能参与了POP的发生、发展。
【关键词】 盆底器官脱垂 胰岛素样生长因子-1 线粒体DNA 胶原蛋白Ⅰ 胶原蛋白Ⅲ
[Abstract] Objective： To study the expression of insulin-like growth factor-1 （IGF-1）， mitochondrial DNA （mtDNA） and collagen Ⅰ， Ⅲ in the tissues of patients with pelvic organ prolapse（POP）. Method： A total of 50 POP patients in our hospital were collected as the study group， and 50 benign non-POP patients who underwent hysterectomy at the same time were selected as the control group. The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA and collagen Ⅲ mRNA， and the gray value of IGF-1， collagen Ⅰ protein， collagen Ⅲ protein were compared between the two groups. Result： The relative density values of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA in the study group were （0.41±0.09）， （0.47±0.08） and （0.56±0.11）， which were lower than （0.85±0.11）， （0.92±0.13） and （0.93±0.12） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The gray values of IGF-1， collagen Ⅰ proteins， collagen Ⅲ proteins in the study group were （3.36±0.12）， （5.44±0.18） and （5.16±0.13）， which were lower than （4.49±0.14）， （7.17±0.19） and （6.87±0.15） in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The level of mtDNA， collagen Ⅰ mRNA， collagen Ⅲ mRNA and IGF-1， collagen Ⅰ protein， and collagen Ⅲ protein expressions of uterosacral ligament-uterine main ligament in POP patients are all down-regulated， which may be involved in the occurrence and development of POP.
盆底器官脫垂（POP）主要是由于盆底支持结构缺陷或者退化、损伤及功能障碍所导致，是影响中老年女性生活质量的常见疾病。POP的发病因素复杂，机体老化、氧化应激在POP的发生发展中扮演着重要角色[1]。有研究发现，机体内过多的活性氧（ROS）可对线粒体DNA（mtDNA）造成氧化损伤[2]。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）作为一促存活因子，在多种细胞系中均表现出其抗氧化应激、抗细胞凋亡的特性[3]。PI3K/AKT信号通路被认为是最主要的促进细胞存活的一条信号通路[4]，mtDNA、IGF-1、PI3K/AKT信号通路在维持机体氧化应激/抗氧化应激平衡过程中有着重要作用，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的变化与POP的发展关系密切。本研究旨在通过检测宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体IGF-1、mtDNA及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达，为防治POP探求新的思路，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集笔者所在医院2018年1月-2019年3月临床POP患者50例作为研究组，同时选择同期行子宫切除术的良性非POP患者50例作为对照组。研究组纳入标准：均为已婚已育女性;经临床确诊为POP患者。对照组纳入标准：均为已婚已育女性;非POP患者;子宫肌瘤、子宫内膜异常增生及宫颈病变患者。排除标准：妇科恶性肿瘤、妊娠期或哺乳期患者;长期服用避孕药、雌激素等激素类药物者;有既往盆腔手术史者;吸烟及滥用药物史者。两组患者均经手术治疗，并获得宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本。研究组年龄（43.51±10.42）岁;POP分期：Ⅱ期11例，Ⅲ期24例，Ⅳ期15例。对照组年龄（43.79±9.89）岁;子宫肌瘤25例，子宫内膜异常增生18例，宫颈病变7例。两组患者基线资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），有可比性。 1.2 方法
两组均于手术治疗时取宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本，获得非POP及POP组织，应用定量RT-PCR方法检测两组宫骶韧带-子宫主韧带复合体离体标本，检测mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA水平的表达，具体步骤：RNA提取、反应体系配制、加RNA模板、RT-PCR反应、2.0%琼脂糖凝胶制备、电泳、RT-PCR产物检测，将电泳胶放入凝胶成像系统观察，以内参基因为基准分析各条带的相对密度值。
采用免疫蛋白印记法（western-blot）检测两组标本IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白的表达。主要步骤：SDS-PAGE凝胶制备及灌胶，上样、电泳、切胶及制备硝酸纤维素膜（PVDF）、转膜、抗原封闭、加入一抗、二抗，在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统分析，评估相对灰度值。
线粒体DNA（mtDNA）核酸检测试剂盒（北京索奥生物医药科技有限公司），人IGF-1试剂盒（厦门慧嘉生物科技有限公司），人胶原蛋白ⅠmRNA、人胶原蛋白Ⅲ mRNA、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白试剂盒（上海科顺生物科技有限公司）;凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
1.3 观察指标
比较两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值。比较两组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值。
1.4 统计学处理
本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值结果比较
研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA相对密度值均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值结果比较
研究组IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白灰度值均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
3 讨论
盆底支持组织主要包括韧带、多层肌肉和筋膜，正常子宫位置的维持需要靠子宫韧带、骨盆底肌和筋膜的共同支托。宫骶韧带-子宫主韧带复合体在盆底支持结构中起最主要支持力量，该韧带复合体正常形态、位置和功能的异常，影响盆底正常功能，可最终导致POP的发生。妊娠、阴道分娩损伤、肥胖、便秘等多种因素是POP的诱因，盆底支持组织中分子生物学水平与POP的发生密切，氧化应激、炎性刺激等参与了POP的发生、发展过程[5]。
本次研究结果显示，研究组mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、胶原蛋白Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均低于对照组（P<0.05）。线粒体是真核细胞能量提供和储存的场所，还在细胞凋亡中发挥重要作用。有学者发现POP患者盆底组织中存在mtDNA缺失和重排的累积，且随着POP程度的加重而明显累积[6]。mtDNA突变和氧化损伤的累积，促进机体的老化，引起盆底支持结构解剖及功能的异常，最终导致POP的发生。ROS主要包括超氧陰离子（O2-）、羟基（-OH）和过氧化氢（H2O2），主要来源于细胞中线粒体。随着年龄的增长，ROS水平呈增长趋势，而ROS清除机制却呈退化趋势，二者之间的平衡被打破，氧化应激导致mtDNA氧化损伤，引起突变，产生有缺陷的电子传递链（ETC）组分，导致更多ROS产生和mtDNA突变，引起呼吸链有关蛋白质亚单位的合成障碍，形成有缺陷的呼吸链，导致机体细胞ATP合成水平降低和细胞能量供给不足，致使细胞损伤[7-8]。
IGF-1的生物学活性是通过在胞外区域与IGF-1受体（IGF-1R）相结合，然后使跨膜区的IGF-1R亚基结构发生改变，引起自身磷酸化作用并激活其亚基内酪氨酸（Tyr）激酶，促使下游底物发生一系列的磷酸化，启动细胞内的PI3K/AKT等信号通路，调整细胞的生长、增殖及凋亡等生物学效应[9-10]。PI3K/AKT信号通路与细胞生长、炎性反应及细胞凋亡有着重要联系。PI3K是胞内磷脂酰肌醇激酶，参与细胞的能量代谢、增殖、分化及凋亡。AKT的激活，进一步激活其下游的分子信号，以直接或者间接的方式来调整细胞的生存与生长[11]。随着年龄的不断增长，氧自由基的产生与清除之间的平衡失调，引起细胞ROS增加，过量的ROS进入细胞核导致核内DNA损伤，引起细胞周期停滞和细胞凋亡。IGF-1可通过激活PI3K/AkT信号通路，提高细胞内SOD、GPx活性，促进细胞ROS的清除[12]。
胶原蛋白含量是决定盆底结缔组织韧性强弱的重要因素，盆底结缔组织中主要含Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白是由3条肽链组成的一种重要的、基本的蛋白质，Ⅰ型胶原蛋白直径较粗，抗张能力强，起支持作用;Ⅲ型胶原蛋白直径较细，柔韧性强。胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ水平下降，胶原合成代谢发生紊乱，引起支撑盆腔肌纤维强度降低，影响盆底结构和功能，使其韧性、弹力降低，导致POP的发生[13]。因此，POP发生的分子机制可能是，mtDNA的氧化损伤、IGF-1通过PI3K/AKT信号发挥其抗氧化应激能力，以优化机体微环境减缓POP的进展，胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成降低，导致盆底子宫韧带形态、位置和功能的失常。
综上所述，POP患者宫骶韧带-子宫主韧带的mtDNA、胶原蛋白Ⅰ mRNA、Ⅲ mRNA及IGF-1、胶原蛋白Ⅰ蛋白、胶原蛋白Ⅲ蛋白表达均为下调趋势，可能参与了POP的发生。
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（收稿日期：2020-01-09） （本文编辑：桑茹南）
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