大鼠缺血心肌KCNE基因表达变化及瑞舒伐他汀对其影响

来源:用户上传      作者: 刘旭帮 张丽华 李小威 牛少辉

　　doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.05.001
　　本实验通过检测急性心肌梗死(AMI)后梗死区周围左室心肌KCNE1、KCNE2的基因表达的变化及瑞舒伐他汀对其表达的作用，探讨心梗后心律失常发生和抗心律失常可能机制。
　　资料与方法
　　健康清洁级(SD)大鼠，体质量200～250g。小动物呼吸机。生物信号采集分析系统。瑞舒伐他丁10mg/片。RNAiso Plus、RT-PCR试剂盒、兔抗鼠KCNE1一抗、兔抗鼠KCNE2一抗、辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗及羊抗兔二抗(1:1 000)。
　　动物模型的制备、分组及取材：Sprague-Dawley健康大鼠称重后用10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠固定在鼠板上，气管插管并连接小动物呼吸及生物信号采集系统，标准肢体导联Ⅱ动态监测心电图［1］。消毒铺巾后在胸骨左缘外心脏搏动最强处纵行切开皮肤、各层组织至肋骨，充分暴露心脏，在左心耳和肺动脉锥间距主动脉根部约2～3mm处用6/0无创伤缝线穿过冠状动脉左前降支(LAD)并结扎；结扎后，前壁心肌组织由鲜红色迅速变为暗红色，逐渐变为苍白，心电图监测肢体导联ST段较前上抬＞0.2mv作为心梗模型制作成功，关闭胸腔后逐层缝合组织，动态监测心电图30分钟。假手术组，于左冠状动脉前降支下穿过缝合线，不结扎，余操作同心梗组。术后存活的40只大鼠，按照随机数字表法分为AMI 24小时组、1周组、4周组和瑞舒伐他汀组，每组各10只。每个时间点均设立假手术组大鼠40只。瑞舒伐他汀组给予瑞舒伐他汀1mg/(kg•日)灌胃给药4周，其余各组均以等量生理盐水灌胃。术后于各时间点取出心脏，用生理盐水冲洗后速取心梗区周围组织均分2份，置于冻存管并放液氮中保存备用。
　　逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测KCNE1，KCNE2 mRNA的表达，取心肌标本组织约100mg，根据试剂盒说明进行操作。
　　免疫印迹法测定量KCNE1、KCNE2蛋白质表达量：取心肌标本组织约100mg剪切成小块，按每100mg组织加1ml的比例加入全蛋白提取液匀浆15分钟，4℃、14 000r/分离心20分钟［2］，取上清20μl测定蛋白浓度，酶标仪测定波长，根据标准曲线计算出蛋白浓度，其余上清中按照1∶4加入上样缓冲液，100℃加热5分钟。按10%SDS-PAGE凝胶电泳分离KCNE1，KCNE2)蛋白，电转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，室温孵育1小时后弃去封闭液，加入一抗，封闭袋中4℃过夜，弃去一抗，用TBS洗涤10分钟×3次。弃去TBS，加入二抗，37℃孵育1小时，弃去二抗，用TBS洗涤10分钟×3次。增强化学发光(ECL)显影，将胶片扫描后用Bandscan 5.0软件进行灰度分析。
　　结 果
　　心律失常动态变化，见表1。
　　讨 论
　　本研究通过检测AMI后梗死周边区心肌组织中KCNE1、KCNE2表达的动态变化的趋势，为探讨心肌梗死后心律失常发生的离子机制提供了实验依据。也探讨了AMI后使用瑞舒伐他汀对KCNE的影响，进一步证实了瑞舒伐他汀抗心律失常的作用机制。
　　参考文献
　　1 佘强,邓松柏,Uta C Hoppe.MiRP1对异源转染的CHO细胞上HCN1和HCN2通道电生理特性的调节.第三军医大学学报,2008,30(12):1129-1131.
　　2 王建设,袁灿,等.大鼠心肌缺血预适应相关基因5的克隆与特性分析［J］.中国动脉硬化杂志,2006,14(3).

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