基于反相液相色谱的人血中茶碱浓度临床检测与分析

来源:用户上传      作者: 顿文亮 周玉 高运军 包贝华

　　[摘要] 目的：建立快速、简便、准确、重现性好的人血中茶碱的测定方法。方法：采用Hypersil ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，流动相为甲醇-水（25∶75），内标物为咖啡因，检测波长为274 nm，血清用甲醇沉淀蛋白后进行分析。结果：茶碱标准曲线回归方程为Y=0.053 9X+0.038，r=0.999 4（n=8），1～40 μg/ml浓度范围线性关系良好。对36例患者作血清茶碱浓度监测，临床效果良好。结论：本测定方法为临床药师指导临床有效、安全的个体化药物的使用提供了保障。
　　[关键词] 茶碱；血药浓度；RP-HPLC；个体化用药
　　[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（a）-074-03
　　
　　Detection of theophylline in human serum and its clinical application based on reversed-phase HPLC
　　DUN Wenliang1, ZHOU Yu2, GAO Yunjun1, Bao Beihua2
　　1.Department of Pharmacy, Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Province, Nanjing 210001, China; 2.College of Pharmaceutical, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province, Nanjing 210029, China
　　[Abstract] Objective: To develop a rapid, simple, accurate and reproducible method for the determination of theophylline in human serum. Methods: The separation was performed on Hypersil ODS C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of methanol-water(25∶75), and the wavelength for detection was 274 nm. The coffeine was used as an internal standard, and methanol was used to precipitate the serum protein. Results: The regression equation of theophylline was Y=0.053 9X+0.038, r=0.999 4 (n=8). The calibration curves of theophylline were linear over the range of 1-40 μg/ml. The clinical application was good for 36 patients through of the detection of theophylline. Conclusion: The method supplies a reasonable guide for the drug use at individual levels.
　　[Key words] Theophylline; Serum concentration; Reversed-phase HPLC; Individualized medication
　　茶碱是临床上最常用的平喘药之一，但茶碱的体内吸收和排泄个体差异很大，并且其有效范围窄，易产生副作用，因此监测茶碱血药浓度对临床治疗显得非常必要[1]。目前HPLC是最常用方法之一，满足临床需要，本实验结合文献[2]，建立了快速、准确、简便、经济、重现性好的茶碱血药浓度的HPLC检测方法。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，LC-10ADVP双泵，SPD-10Avp紫外检测器，LC solution色谱工作站，Ts 0.5/20型超声波电源，HP-01真空泵，1612-高速离心机，SK-1型快速混匀器，SC-230海尔冰箱，AL104电子天平。
　　1.2 药品与试剂
　　茶碱（购自中国药品生物制品检定所，批号：100121-199903）、咖啡因（购自中国药品生物制品检定所，批号：171215-200809，含量为99.9%），甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水经微孔滤膜过滤。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　色谱柱：Hypersil ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75）（V/V）；检测波长：274 nm；流速：1 ml/min；柱温：30℃。
　　2.2 茶碱标准品溶液的制备
　　精密称取茶碱标准品4.0 mg，甲醇溶解定容，配制成0.4 mg/ml的储备液，临用时用超纯水稀释到相应的浓度。
　　2.3 内标溶液的制备
　　精密称取咖啡因3.0 mg，加入甲醇超声溶解定容，配制成150 μg/ml的咖啡因溶液为内标。样品均4℃保存备用。
　　2.4 血清样本的预处理
　　取血清样本200 μl置入1.5 ml离心管中，加入10 μl甲醇，再加入150 μg/ml的内标物咖啡因储备液10 μl，混匀振荡10 s，加入甲醇300 μl，混匀振荡1 min，置15 000 r/min高速离心机离心10 min。吸取上清液，抽滤后转入1.5 ml的离心管中，取20 μl样品进行色谱分析。
　　2.5 专属性考察
　　按“2.4”项下血清样本处理方法处理，得空白血清、血清加对照品和内标色谱图。见图1。
　　
　　A. 空白血清；B.血清加对照品和内标；1.茶碱；2.咖啡因
　　图1 空白血清、血清加对照品和内标的高效液相图谱
　　
　　由图1可见，茶碱和咖啡保留时间分别是5.6 min和8.1 min，两峰分离完全，峰形良好，内源性物质对测定无干扰，
　　2.6 线性关系考察
　　取人空白血清200 μl，置于1.5 ml的离心管中，加入不同浓度的茶碱标准液（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40 mg/ml甲醇配制）各10 μl，得茶碱血药浓度为1、2、3、4、5、10、20、40 μg/ml的系列标准血样。按“2.4”项下血清样本的处理过程操作，记录样品和内标峰面积。以浓度（X）为横坐标，茶碱标准溶液峰面积与内标峰面积之比（Y）为纵坐标进行线性回归。结果得回归方程为Y=0.053 9X+0.038，r=0.999 4（n=8），线性范围为1～40 μg/ml。表明茶碱标准品在1～40 μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好。见图2。
　　
　　图2 茶碱的标准曲线
　　2.7 精密度试验

　　取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml低、中、高溶液同日内测定5次，连续5 d，每天测定1次，计算日内精密度、日间精密度。见表1。
　　
　　表1 茶碱日内、日间精密度试验结果（n=5）
　　
　　2.8 稳定性试验
　　取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml每一浓度进行5个样本分析，考察茶碱血清样品经历冷冻――解冻循环的稳定性。见表2。
　　
　　表2 茶碱稳定性试验结果（n=5）
　　
　　2.9 回收率试验
　　取空白血清中茶碱浓度为2、4、20 μg/ml低、中、高溶液，按按“2.4”项下血清样本的处理过程操作，同时以流动相代替空白血清，配制2、4、20 μg/ml浓度的茶碱标准溶液。以血清样品与标准品峰面积比值计算提取回收率，由同步操作制备的标准曲线计算每个血样的实测浓度，将求得的浓度与已知加入浓度相比，计算血样茶碱的相对回收率。见表3。
　　
　　表3 茶碱提取及相对回收率试验结果（n=5）
　　
　　2.10 临床应用
　　对呼吸科、老年科、ICU连续使用茶碱6 d血药浓度达稳态时的住院患者（共计36例），于次日早上7：00左右空腹取血行茶碱的血药物浓度检测。结果显示，患者茶碱血药浓度在2～26 μg/ml之间。见表4。
　　
　　表4 36例住院患者茶碱血药浓度的测定结果
　　
　　3 讨论
　　3.1 茶碱血药浓度检测方法的选择
　　目前，常用茶碱的测定方法有高效液相色谱法（HPLC）、紫外分光光度法（UV）、荧光偏振免疫分析法（FPIA）、化学发光酶免疫法（CLEIA）。紫外分光光度法测定茶碱的血药浓度[3-4]在这几种方法中成本最低，但灵敏度及分辨率差，计算麻烦；荧光偏振免疫分析法和化学发光酶免疫法操作简单，专属性高，但荧光偏振免疫分析法需要TDx仪来测定血药浓度，价格昂贵；化学发光酶免疫法定标有效期短[5-7]。本实验对茶碱血药浓度的检测，首先考虑方法有效性（专一性强、灵敏度好、变异系数低、回收率高），其次是周期短、成本低、样本处理简单等因素，故采用高效液相色谱法。
　　3.2 HPLC法检测茶碱血药浓度的条件选择
　　3.2.1 流动相的选择 在HPLC测定茶碱的方法中，目前文献报道的茶碱测定的流动相选择主要为醋酸盐缓冲液-乙腈[8]、甲醇-水[9]、磷酸二氢钾-乙腈[10]、甲醇-水-醋酸溶液[11]、三乙胺缓冲液-甲醇[12]，笔者对比了流动相甲醇-水和甲醇-水-醋酸盐缓冲溶液两者的保留时间和峰面积基本一致，甲醇-水-醋酸盐缓冲溶液峰形更尖锐，峰高更高。两者都能对茶碱进行很好的色谱分析，但甲醇-水作为流动相廉价易得，更为经济，而且比使用含有醋酸缓冲液的流动相更能延长分析柱的寿命，因此本文建议采用甲醇-水为流动相。同时也发现流动相中随着甲醇比例的提高，茶碱的保留时间明显缩短，当甲醇比例太高，茶碱组分分离效果不理想。通过预试验最后确定甲醇-水（25∶75）作为流动相。此比例茶碱的出峰时间亦在5 min左右，保留时间均在15 min以内，是主峰出峰时间的3倍。而且被测成分分离效果较好，峰形也良好。
　　3.2.2 样本处理方法的选择 血浆样品的处理方法有萃取法、蛋白沉淀法等。二氯甲烷-异丙醇[13]、氯仿-异丙醇萃取[14]。萃取法的血样本干扰少，最低检测限高。但其操作繁琐，操作一致性和稳定性较差，同时有机溶剂（如氯仿）对人体伤害大。有文献报道蛋白沉淀法选用三氯醋酸、高氯酸、甲醇等作为蛋白沉淀剂，前两者提取回收率较高，但考虑到酸性沉淀剂可能损坏色谱柱，故选用甲醇沉淀蛋白[15]。
　　3.3 临床茶碱监测与分析
　　影响血药浓度的因素是多方面的，它与药物剂型、给药剂量、给药间隔、给药方式、患者的生理状况、病理状况等是密切相关的。茶碱的药理作用与血浓度有关，其有效血浓度安全范围很窄，茶碱浓度维持在5～15 μg/ml可达到较好的疗效，超过20 μg/ml即能引起毒性反应[16]。
　　茶碱血药浓度监测者中有4例大于20 μg/ml，可能原因：第一，与患者的肝肾功能异常有关，使茶碱的清除率下降，半衰期延长。第二，与其他药物配伍使用有关，如氟喹诺酮类等可降低茶碱清除率，增加其血药浓度。第三，与患者高龄生理状况有关，老年人血浆蛋白减少，会使游离型药物增多；机体水分减少，脂肪增加，药物血药浓度增高，不良反应增加。有9例血药浓度小于5 μg/ml，一是可能诱导了P450肝药酶，如酗酒、吸烟等，使其血药浓度下降。二是与其他药物配伍使用有关，如钙拮抗剂以及偏酸性的药物。三是给药剂量、间隔不当，正常成年人茶碱的半衰期为（8.7±2.2） h，如1日1次普通片剂或是尽管1日2次普通片剂，但2次间隔很近或是剂量不足，不能达到有效的血药浓度。这些因素都会影响茶碱在体内的分布、吸收、代谢及排泄，从而影响了患者体内的血药浓度。尽管影响茶碱的血药浓度因素有很多，但是依据此方法检测出的数据，并做适当的调整，使茶碱的给药剂量更加安全、有效。
　　
　　[参考文献]
　　[1] 王广基.药物代谢动力学[M].北京:化学工业出版社,2005:127-128.
　　[2] 张莉,张明香,徐兵,等.高效液相色谱法同时测定患者血清中茶碱和多索茶碱的浓度[J].中国医院药学杂志,2009,29(22):1964-1965.
　　[3] 李乃静,李岩,潘作东,等.紫外分光光度法测定氨茶碱的血浆药物浓度[J].中国医学工程,2009,17(3):202-203.
　　[4] 魏桂林,赖庆文,廖志宪.紫外分光光度法测定茶碱的血药浓度[J].中国现代药物应用,2008,2(6):9-10.
　　[5] 杨秀斐,余玉木,徐克.荧光偏振免疫分析法与化学发光酶免疫法测定人血浆茶碱浓度[J].医药导报,2006,25(5):403-404.
　　[6] 杨爱群,曾佳,陈永,等.两种测定氨茶碱血药浓度方法的准确度比较[J].解剖学研究,2008,30(1):18-20.
　　[7] 鲁晟,蔡云祥.化学发光酶免疫法与高效液相色谱法测定血清茶碱浓度的比较[J].中国药业,2010,19(12):29-30.
　　[8] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:513.
　　[9] Jin CH, Lee JW, Row KH. Prediction of elution bandwidth for purine compounds by a retention model in reversed-phase HPLC with linear-gradient elution [J]. J Sep Sci,2008,31(1):23-29.
　　[10] Hadad GM, El-Gindy A, Mahmoud WM. New validated liquid chromatographic and chemometrics-assisted UV spectroscopic methods for the determination of two multicomponent cough mixtures in syrup [J]. J AOAC Int,2008,91(1):39-51.
　　[11] Lo Coco F, Lanuzza F, Micali G, et al. Determination of theobromine, theophylline, and caffeine in by-products of cupuacu and cacao seeds by high-performance liquid chromatography [J]. J Chromatogr Sci,2007,45(5):273-275.
　　[12] Jain JK, Prakash MS, Mishra RK, et al. Simultaneous determination of multi drug components Theophylline, Etofylline, Guaiphenesine and Ambroxol Hydrochloride by validated RP-HPLC method in liquid dosage form [J]. Pak J Pharm Sci,2008,21(2):151-158.
　　[13] 阚全程,李朵璐,师秀琴.HPLC测定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶碱浓度及其药动学研究[J].药物分析杂志,2009,29(5):845-849.
　　[14] 朱立勤,姚淑娟,焦建杰,等.HPLC法测定人体茶碱血药浓度条件的筛选[J].天津医科大学学报,2005,11(1):36-38.
　　[15] 刘奕芳,沈维敏,沈杰.人血浆中茶碱和多索茶碱的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志,2010,41(2):131-133.
　　[16] 何瑾,周琼,张峻.茶碱不同给药方案与其血药浓度关系的研究[J].昆明医学院学报,2010,31(5):42-45.
　　（收稿日期：2011-10-21）

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