杂交构树茎段组织培养体系的建立

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　　摘要：以杂交构树[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]——中科一号为试验材料，通过对杂交构树茎段的离体培养和扩繁，探究了不同激素配比对杂交构树诱导愈伤、丛生芽、壮苗和生根的影响。试验结果表明，以具腋芽的构树茎段为外植体材料，75%乙醇溶液浸泡 40 s后，再经0.3% HgCl2灭菌15 min，外植体的成活率可达44%;诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，愈伤诱导率达90%;诱导丛生芽的最佳培养基为MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA  2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，丛生芽增殖系数为4.2，生长势较好;壮苗的最佳培养基为MS+IBA 0.2 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，平均株高4.8 cm;生根的最佳培养基为1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+活性炭1.5 g/L+马铃薯50 g/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 5.6～5.8，生根率100%。最佳的炼苗移栽基质土为珍珠岩∶蛭石∶草炭=1∶1∶1的混合基质，幼苗生长得最好，平均株高为7.3 cm。
　　关键词：杂交构树[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.];组织培养;愈伤组织;丛生芽
　　中图分类号：Q813.1;S792         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0120-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.029           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： The hybrid tree[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]—Zhongke No. 1 was used as the experimental material， through the culture and expansion of the stem segments of the hybrid tree in vitro， the effects of different hormones on callus， shoot buds， strong seedlings and roots were studied. The results showed that the survival rate of explant material， stems of the buds with axillary buds， could reach 44%， after immersed in 75% ethanol solution for 40 s， then sterilized by 0.3% HgCl2 for 15 min. The optimal medium for inducing callus is MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L， pH 5.6～5.8， the callus induction rate reached 90%. The optimal medium for inducing cluster buds was MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L，pH 5.6～5.8， the growth coefficient of cluster buds is 4.2， and the growth potential is good. The optimal medium for strong seedlings is MS+0.2 mg/L IBA+6-BA 1.5 mg/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L， pH 5.6～5.8， average plant height is 4.8 cm. The optimal medium for rooting is 1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+activated carbon 1.5 g/L+potato 50 g/L+sucrose 25 g/L+agar 7.0 g/L，pH 5.6～5.8， rooting rate is 100%. The best seedling transplanting substrate soil is a mixed substrate of peat∶perlite∶vermiculite=1∶1∶1. The seedlings grow best， with an average plant height of 7.3 cm.
　　Key words： hybrid Broussonetia papyrifera; tissue culture; callus; bush bud
　　構树（Broussonetia papyrifera），别名楮树、谷浆树、野杨梅子等，为桑科（Moreceae）构树属（Broussonetia）多年生雌雄异株落叶乔木，树冠张开，全株含乳汁，普通构树小枝和侧芽均密生柔毛[1]。其根与果实均可入药，且具有强筋骨、补肾、利尿之功效，能治腰膝不适等症状，果实中的红色素还具有一定的抗氧化作用[2];其侧芽和叶片幼嫩时可食，戚亚伟等[3]研究表明，构树叶对小鼠因摄食过多而导致的肥胖有治疗效果，并能促进其体内油脂代谢，减少内脏脂肪。构树的材质洁白，纤维素含量高且表面光滑，和其树皮一直是造纸业及新型纺纱业等的优质原料[4，5];其乳汁不仅能医治疮癣等皮肤病，还具有开发成生物杀虫剂的潜力，能杀死一些蔬菜害虫[6]。其还具有吸附空气中有害气体和灰尘、净化空气的功能，是较为优良的生态园林绿化树种[1]。瞿晓晶等[7]研究表明，构树种子油对羟基等自由基的抑制率高达93.56%。因此，构树全身都是宝，其开发和利用一直受到国内外学者的广泛关注，经济潜力很大[8]。 　　由中国科学院选育的杂交构树[Broussonetia papyrifera （L.） Vent.]——中科一號，不仅具有普通构树的优良特性，而且具有速生、适种地广、抗逆性强、易繁殖、热量高、轮伐期短等栽培特性[9]，更适用于造纸业的需求[10]。在中国，不论平原、丘陵或山地，杂交构树都能旺盛生长，是良好的经济林和生态林品种[11]。其根系浅，侧根分布很广，生长快、萌芽力和分蘖力强，可避免水土流失;其叶片无柔毛且富含大量的粗蛋白质以及类黄酮，具有抑菌抗癌的作用[12-15]，无需施用农药和激素，且具清香味，因此更适用于保健蔬菜、茶叶的制作以及各种饲料添加物的加工和制备[12，14]。
　　构树种子人工播种的发芽率低，仅4%，且后代会发生性状分离，无法保证母本的优良性状，因此构树苗木主要靠扦插繁殖[1]，但扦插难以满足当前大面积栽培及推广的需要，扦插苗后期主干容易空心且长势较弱，而利用组培快繁的技术正好可以解决杂交构树资源短缺与需求量日益增长之间的矛盾[16]。为此，试验通过优化消毒方法和激素配比，进行愈伤组织、丛生芽和生根的诱导，建立了杂交构树的组织培养体系，旨在为构树的大量快繁奠定基础，同时，也可减轻对构树野生资源的采挖和破坏，实现良好的生态效益。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　试验材料从湖北省农业科学院果树茶叶研究所构树试验园采集。选择晴天上午采集生长健壮、无病害的幼嫩构树枝条，以带腋芽的构树枝条为宜，采集200条，将样品带回实验室，进行外植体的消毒和接种。
　　1.2  试验方法
　　1.2.1  试验条件  以MS为基本培养基，主要调整激素种类和浓度形成不同培养基组合，16 h光照/8 h黑暗，光照度3 000 lx，培养温度（24±1） ℃。
　　1.2.2  试验材料的获取及消毒  选取健壮的构树枝条为外植体，首先将枝条放入加有洗洁精或吐温40的水中浸泡20 min，然后将构树枝条在自来水下冲洗30 min，除去其表面泥土和灰尘，按1～2 cm的长度且都带腋芽为标准剪成茎段，再将冲洗干净的外植体放入超净台中，用75%乙醇浸泡40 s，经无菌水冲洗3次，再置于消毒剂中灭菌，并设置空白对照（无菌水）。消毒剂分别为2% NaClO、0.3% HgCl2和10% H2O2溶液，灭菌时间分别设定为5、10、15 min。并用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干构树侧芽表面水分，切除两端因消毒坏死的组织，迅速将侧芽接种到培养基中，每瓶接种2个，25瓶为一个小组，共接种12组，光照培养室中培养10 d后统计侧芽的污染率、灭菌死亡率和成活率。
　　1.2.3  愈伤组织及丛生芽的诱导  以MS+琼脂7 g/L+蔗糖25 g/L（pH 5.6～5.8）为基础培养基，加入不同浓度的IBA和6-BA。IBA设置0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L等4个水平，6-BA设置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 等5个水平。将1 cm左右的构树茎段（带腋芽）接入培养基中进行培养。一共20个处理，每个处理20瓶，每瓶接种3株无菌芽苗，培养30 d后观察并记录愈伤组织及芽苗的生长情况。
　　1.2.4  壮苗培养基的筛选  以MS+琼脂7 g/L+蔗糖25 g/L+马铃薯（榨汁）50 g/L（pH 5.6～5.8）为基础培养基，加入不同浓度的6-BA和IBA。6-BA设置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L等5个水平，IBA设置0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L等4个水平。选择长势较好的基础苗进行壮苗，一共20个处理，每个处理20瓶，每瓶接种3株无菌芽苗。接种后置于光照培养室中，30 d后观察并记录壮苗结果。
　　1.2.5  构树生根培养基的筛选  以1/2 MS+琼脂 7 g/L+蔗糖25 g/L+活性炭1 g/L+马铃薯（榨汁）  50 g/L（pH 5.6～5.8）为基础培养基，加入不同浓度的IBA。IBA设置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L等5个处理，每个处理20瓶，每瓶接种3株无菌芽苗，培养30 d后观察并记录构树植株的生根和生长情况。
　　1.2.6  构树的炼苗和移栽  将长有构树幼苗的培养瓶转移至炼苗温室内，开盖炼苗2 d后，洗干净幼苗根部黏附的培养基，将幼苗移入珍珠岩∶蛭石∶草炭=1∶1∶1混合基质的营养钵中并浇足水，用喷雾保湿，同时注意通风，随后逐渐降低湿度，30 d后移出炼苗温室，让幼苗在自然条件下生长，观察并记录移栽结果。
　　2  结果与分析
　　2.1  不同消毒方法的比较
　　从表1可以看出，消毒效果最好的处理是75%乙醇溶液浸泡40 s后再用0.3% HgCl2灭菌15 min，除菌率可以达到68%，外植体的成活率可达44%。
　　2.2  杂交构树愈伤组织及丛生芽诱导培养基的筛选
　　杂交构树茎段在诱导培养基中培养30 d后，观察不同激素配比下芽苗的增殖系数与芽苗生长状况。由表2可知，在IBA浓度一定的情况下，随着6-BA浓度的升高产生愈伤增加;在6-BA浓度一定的情况下，随着IBA浓度的升高，产生愈伤组织也有类似的增加趋势。产生愈伤的最佳培养基为MS+IBA 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8），诱导愈伤组织的效果最明显，诱导率为90%，生长势也较好;而产生丛生芽的最佳培养基为MS+IBA 1.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8），愈伤组织的诱导率虽然仅为55%，但是丛生芽增殖系数为4.2，生长势也较好。 　　2.3  杂交构树壮苗培养基的筛选
　　由表3分析可得，對壮苗影响较大的激素为6-BA，当6-BA浓度为1.5 mg/L，IBA浓度为 0.5 mg/L时，壮苗效果最明显，虽然丛生芽增殖系数仅为3.8，但是此时芽苗的平均株高为4.8 cm。由此可得壮苗效果最佳的培养基配方为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.20 mg/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8）。
　　2.4  杂交构树生根培养基的对比结果
　　以1/2 MS为基本培养基加IBA和马铃薯汁可加快杂交构树组培苗生根，接种至生根培养基10 d后可以看到根原基分化出的愈伤组织，15 d后就可看到诱导出许多细小的不定根，30 d后生根的结果就趋于稳定了。从表4可以看出，随着IBA浓度的升高生根率增加，当IBA浓度为0.8和1.0 mg/L时，生根率均为100%。考虑到激素过高可能会影响细胞活性等因素，选取低浓度的IBA，故最佳的生根培养基为1/2 MS+IBA 0.8 mg/L+活性炭1.5 g/L+马铃薯50 g/L+蔗糖25 g/L+琼脂7.0 g/L（pH 5.6～5.8）。
　　2.5 构树幼苗的驯化移栽
　　从表5可以看出，杂交构树幼苗在移栽到蛭石和草炭中的成活率要明显高于珍珠岩，可能是由于珍珠岩不保水，移栽后的幼苗容易失水，严重萎蔫，生长不良;但是在珍珠岩∶蛭石∶草炭（1∶1∶1）混合的基质土中的幼苗生长最好，移栽25 d后，平均株高为7.3 cm，长高了2～3 cm，不仅原来的根系更长更壮，新根也出了1～2条，侧芽也明显变大。
　　3  小结与讨论
　　试验对杂交构树品种中科一号的茎段进行组织培养，通过调整激素配比，构建了一套能运用于试验和小规模生产的组织培养体系，为后续高效的组织培养试验奠定了基础。发展杂交构树符合“以树代粮”和“绿水青山就是金山银山”的发展理念，对于改善农业发展，构建良好生态环境都具有促进作用，是一项能为社会带来生态效益和经济效益的工作，而无菌的脱毒材料是构树组织培养和大量扩繁的重要前提。杂交构树茎段的消毒，时间过长可能会对构树茎段尤其是对腋芽造成毒害，影响其活力;时间过短则会造成消毒不彻底。本试验的最佳灭菌方法为75%乙醇溶液浸泡40 s后，再用0.3% HgCl2灭菌15 min，除了考虑选择何种灭菌剂外，还综合考虑了灭菌时间对灭菌效果的影响[17，18]。
　　在组织培养中，生长素类物质的主要作用是促进根和茎等组织的延伸和生长，诱导外植体产生愈伤组织;细胞分裂素类物质的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导体胚和不定芽的形成。在离体条件下，器官的诱导并不是由某种生长激素的浓度所决定，而是由那些参与分化的物质间的比例关系所决定，当 6-BA与IBA的比例低时有利于愈伤组织的形成和芽的生长;比例高时有利于芽的分化[18]。本试验研究结果表明，诱导愈伤组织分化时6-BA与IBA的适宜比例为4∶1;壮苗时6-BA与IBA的适宜比例为4∶3;用IBA生根效果就很好，与刘芸等[18]、曹帮华等[19]、万文等[20]报道的生长激素使用趋势相符合。
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　　收稿日期：2018-11-19
　　基金项目：湖北省农业科技重点课题与平台专项（2017-620-005-003）;湖北省农业科技创新中心项目（2017-620-005-001）
　　作者简介：田  瑞（1978-），男，湖北荆门人，副研究员，硕士，主要从事果树种质资源的研究工作，（电话）15971470058（电子信箱） 79011129@qq.com;通信作者，秦仲麒（1962-），男，研究员，（电子信箱）zhongqiqin@163.com。
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