水产品中呋喃它酮代谢物AMOZ残留的测定
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摘 要：为保证水产品质量安全，用酶联免疫试剂盒检测鱼类水产品中呋喃它酮代谢物的残留。检测结果表明，AMOZ标准半对数曲线为Y=﹣22.34X+67.42，R2=0.9965，试剂盒在添加量为0.5、1.0、2.0μg/kg时，平均回收率分别为94.67%、106.67%、98.17%，除个别产品不符合规定外，绝大部分水产品未检出AMOZ。酶联免疫法适合对水产品中AMOZ的残留做快速检测。
关键词：呋喃它酮;ELISA法;水产品
呋喃它酮（Furaltadone）是一种人工合成的硝基呋喃类广谱抗生素，对多类细菌、真菌以及原虫，都可以起到有效的抑制和灭杀效果，同时，使用呋喃它酮时，细菌很难产生耐药性，并且与其他药物一同使用时，也不会产生交叉耐药性。基于此类药物所体现出的特点，已经在蜜蜂、畜禽、水产等养殖业得到了广泛应用，可有效，同时还可以添加至饲料中，作为促生长剂使用。呋喃它酮对光具有较强的敏感性，将其作用于动物机体内后，其半衰期时间较短，一般为几个小时，在对样品进行检测时，是无法发现原药的。但是此种物质的代谢产物，会在动物组织内停留较长时间，与细胞膜上的蛋白质结合形成结合态可在体内残留数周，甚至可传给后代，并且当含代谢物的食品被人类食用后，在胃液的酸性条件下代谢物可从蛋白质中水解出来被人体吸收，因此在分析呋喃它酮的残留时经常要分析其代谢后的产物。国内外研究表明，呋喃它酮具有严重的致癌、致畸、致突变等毒副作用。
基于呋喃它酮所表现出的危害性，欧盟组织于1995年开始，明确规定不得将其用于食用性动物中，在检验中禁止检测出呋喃它酮，以避免对人体健康造成影响。同时，我国在2002年，农业部也做出了该方面的规定，在针对动物性食品进行检验时，不得检测出呋喃它酮。然而，由于其具有高效、廉价等特点，在动物源性食品中，特别是水产品中检出呋喃它酮代谢物的残留案例仍有发生，针对这种现状，如何通过更加简便、高效、精准的方法，检测出食用性动物体内的呋喃它酮，对加强食物安全监督就显得尤为重要。现阶段，在检测动物源性食品中呋喃它酮残留时，一般需要先进行衍生处理，然后再采用高效液相色谱法、酶联免疫法、胶体金免疫层析技术、液相色谱-串联质谱法等手段，完成对呋喃它酮的检测，确定是否含有此类物质。仪器分析法具有较高的准确性，可保证检测结果的精准度，但也存在一定的局限性，所用设备成本较高，耗费的时间较长，检测有效率较低，并且对操作人员专业性有着较高要求，在进行大规模筛选检测时，不适合采用该方法。而酶联免疫法具有较高的灵敏度，检测成本较低、整个过程操作较为简单，且特异性良好，在进行快速筛选检测时有着较为理想的应用效果。本试验主要使用酶联免疫法快速检测鱼类水产品中呋喃它酮代谢物AMOZ的残留。
一、检测原理
测定的基础是竞争性酶联免疫反应，酶标板微孔条上包被有针对被测物抗体的抗体，加入标准品或样品、酶标记物、被测物抗体溶液于板孔中，游离的被测物与酶标记物竞争抗体结合位点，同时被测物抗体也与微孔条上固定的抗体结合，洗去沒有结合的酶标记物，然后将发色剂加入到板孔中并孵育，结合的酶标记物可以将粉红色的发色剂转化为蓝色产物，加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm处测定吸光度，在一定浓度范围内吸光度值与被测物浓度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应稀释倍数即可得出样本中呋喃它酮代谢物的残留量。
二、材料与仪器
1.主要仪器
MK3型酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司;数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂;刀式研磨仪：RETSCH公司;PL602-L电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;3-18k型高速冷冻离心机：Sigma公司;多管漩涡混合仪：美国安胜科技有限公司;N-EVAP-24氮吹仪：美国Organomation公司。
2.试剂与溶液
呋喃它酮试剂盒：德国拜发集团;检测下限为0.2μg/kg，包括：96孔酶标板、AMOZ标准品（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/mL）、洗涤缓冲液（盐）、抗体、酶标记物、基质/发色剂、反应终止液等。呋喃类组织前处理试剂盒：德国拜发集团;包括：1号试剂、2号试剂、3号试剂、4号试剂。正己烷：天津市富宇精细化工有限公司，乙酸乙酯：广州化学试剂厂。
三、实验步骤
1.样品处理
鱼去皮，取背部肌肉，用刀式研磨仪制成均质物。
2.样品制备
（1）称取0.9g已均质的样品于15mL离心管中，依次加入3.6mL蒸馏水、0.45mL1号试剂、108μL2号试剂。
（2）振荡混匀后，在50℃培养3h或者37℃恒温培养16h。
（3）分别加入4.5mL3号试剂、0.36mL4号试剂、4.5mL乙酸乙酯，涡旋震荡30秒。
（4）在室温20-25℃下转速4000rpm离心10分钟。
（5）取2.5mL上清液到一干净离心管中，通过热氮气吹干（50-60℃水浴）。
（6）加入1mL的正己烷到吹干的样品管中溶解干燥物，加入1mL洗涤液，均匀混合。
（7）室温下转速4000rpm离心10分钟。
（8）弃除上层有机溶液（如中间有乳化层，也一并弃除），每孔取出适量的下清液备用。
3.测定
（1）将呋喃它酮试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。
（2）取出足够数量的微孔条插入微孔架，各个标准液（0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb）和每份待测样品均做2个平行样，并记录标准品及样品的位置。
（3）加入50μL的标准品或处理好的样品到各自的微孔中。
（4）加入50μL酶标记物到微孔底部，用手将轻轻摇动微孔板混合。 （5）加入50μL抗体到微孔底部，轻敲微孔架四周，使其充分混合后于室温（20-25℃）下避光静置温育60min。
（6）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（至少拍打三次）以完全除去孔中的液体（如果有气泡，可用吸耳球吹破），用多通道移液器向孔中加满250μL洗涤缓冲液，再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。
（7）加入100μL基质/发色试剂到微孔中，轻敲微孔架四周，使其充分混合。
（8）于室温下避光静置温育15min。
（9）于每一微孔中加入100μL反应终止液，用手将轻轻摇动微孔板混合。
（10）用酶标仪于波长450nm下进行吸光度测定。
4.数据处理
以标准品百分吸光度为纵坐标，标准品浓度对数值为横坐标，绘制标准半对数曲线图。将样品的百分吸光度代入标准曲线中，从标准半对数曲线中读出样品所对应的浓度，乘以前处理时的稀释倍数即为样品中呋喃它酮代谢物的实际浓度。
四、结果
1.AMOZ标准曲线
根据AMOZ标准品的ELISA检测结果绘制标准半对数曲线，见图 1。
AMOZ标准半对数曲线从图 1可知，标准曲线方程为Y=﹣22.34X+67.42，相关系数R2=0.9965。式中：Y为B/B0×100;X为样品浓度的对数值。
2.回收率检测
向0.9g生鱼空白样品中分别加入0.45、0.9、1.8ng的AMOZ标准样品，每个浓度做3个平行，然后按照3.2和3.3的步骤进行前处理及检测。实验结果见表 1。
从表 1可以看出：呋喃它酮代谢物回收率在92.00%～113.00%，平均值為99.83%。
3.各鱼样的检测结果
共检测了18份水产品，各样品的测定结果见表 2。
从表 2的结果中可以看出，鲩鱼、鳊鱼2个样品都检出了AMOZ残留，测定结果分别为0.27、0.61μg/kg，其他样品都未检出。
五、结语
本试验采用ELISA法对水产品中呋喃它酮代谢物的残留状况进行了检测，结果表明绝大多数的样品符合规定，只有极少数部分有检出。
ELISA是酶标抗体与抗原进行的抗原-抗体反应。由于酶的专一性催化作用，酶标板上可同时检测多份样品，故操作简易，灵敏度高，重现性好。本实验的平均回收率在94.67%～106.67%之间，且在0.1～8.1ng/mL测量范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9965。呋喃它酮代谢物含量与百分吸光度的线性方程为Y=﹣22.34X+67.42，因此ELISA非常适于大批量检测水产品中AMOZ残留含量。本方法作为一种快速筛选手段，配合精密仪器确证使用，在日常水产品大批量监测中有着十分广阔的应用前景。
参考文献：
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