淮山组培褐变及其防止措施

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　　[摘要]笔者在前人研究的基础上，结合淮山组培实践，介绍了淮山组培褐变的发生机制及影响因素，归纳其防止措施，以期提供理论参考。
　　[关键词]淮山;组织培养;褐变;防止措施
　　淮山又名山药（Dioscoreaopposita），是国家卫生部公布的一种菜、粮、药兼用的薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）藤蔓生根茎类植物"。淮山在泉州市繁育种植有近三百年的历史，是我市的地方特色农产品之一同。目前淮山主产区主要采用薯块和零余子制种繁殖，这种营养繁殖方式病虫害较多，而且种性容易退化，产量和品质难以保障。运用组织培养技术是繁育淮山良种最为有效的方法之一，不仅能保持原有优良性状不变，同时还可加快品种提纯复壮及繁种速度，是目前淮山优良品种迅速推广种植的一条较为实用的途径。已有学者开展了淮山组织培养研究。但在淮山组织培养中褐变现象特别严重，影响培养物的生长发育，增殖率低，甚至导致培养物死亡。目前有关淮山组织培养快速繁殖中的褐变问题，主要是通过选取同一试验材料，对不同条件下（外植体、培养条件、培养基质以及抗褐化剂等）淮山组织培养过程中出现的褐变现象开展研究。笔者在前人研究的基础上，结合近年来的工作实践，分析褐变产生的机理、影响因素并提出适当的解决办法，以期为淮山组培提供理论参考。
　　1淮山组培褐变
　　1.1淮山组培褐变发生机制
　　褐变，也称褐化，是外植体在离体培养过程中，培养物从伤口处分泌褐色物质进而导致自身长势不佳甚至死亡的现象。组培褐化主要发生在外植体的初代培养时期，在植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体培养中也经常发生。
　　褐变根据其作用机制分为酶促褐变和非酶促褐变。大多数学者认为，淮山组织培养中外植体的褐变属于酶促褐变（又称酚污染），酶促褐变需要酶、底物（主要是酚类化合物）及氧气的参与。淮山含有较多的酚类和醌类化合物，正常情况下，酶分布在细胞质或质体内，酚类化合物分布在细胞液泡中，两者是隔离的，并不发生反应。在淮山的组织培养过程中，由于外植体被切割，细胞组织遭到严重破坏，氧随即大量侵人，损伤切面细胞中的酚类化合物在酚氧化酶的催化作用下脱水聚合，并产生棕褐色醌类化合物，使得外植体切面迅速变成棕褐色或暗褐色;接种快繁时该有毒物质逐步扩散至培养基中，抑制其它酶的活性，从而影响外植体的脱分化、再分化和组培苗的生长，甚至最终致使外植体死亡。与酶促褐变相比，非酶促褐变是由外界条件引起的，它是由于细胞受胁迫条件或其他不利条件的影响导致的细胞程序化死亡，或自然发生的细胞死亡即坏死而形成的褐变现象，其中并无酚类物质的产生和参与。这种褐变如在操作过程中采取适当的措施，就不会再发生。
　　1.2淮山组培褐变的影响因素
　　实验研究认为，淮山组织培养过程中外植体褐变发生的原因有两个方面：一是内部的原因，即外植体的生理状态、生长状况及遗传特性等因素;二是外部的原因，即外植体所处的培养环境，包括培养基的组成成分、培养条件、褐变抑制剂等。
　　1.2.1淮山种类及基因型
　　在植物的组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶（PPO）活性的差异有关。笔者在准山组培快繁过程中也发现，外植体材料的基因型不同，褐变程度也不同。在无菌体系建立的过程中发现，安溪本地品种“山格”和德化英山的“寸金薯"的外植体褐变严重，成活率极低;而泉淮1547和泉淮1515等淮山新品系的褐变率低，茎叶生长良好。因此，在组织培养工作外植体的选择上应注意此类问题。
　　1.2.2外植体生长部位、生理状态及受伤程度
　　外植体（茎尖、茎段、皮层、表皮、块茎、花瓣、根、葉、子叶、鳞茎、胚珠和花药等）的选择在植物组培快繁中起着至关重要的作用。目前，淮山组培中使用的外植体主要有茎段（带顶芽和腋芽）、叶、零余子、块茎、珠芽和原生质体等。不同生长部位、不同生理状态及受伤程度的外植体对淮山褐变程度有一定的影响。蔡建荣（2008）以福建龙岩大池镇寸金薯为供试材料，结果表明：含酚类物质较多，损伤面积较大的零余子材料褐化较为严重。潘娟等（2009）的研究发现，幼嫩的组织在接种后褐变程度较老熟的组织轻;切口越大，褐化程度越严重;一般在生长季节植物体含较多的酚类化合物，易褐化;幼嫩茎尖较其他部位褐化程度严重。因此，选取合适的外植体可有效地控制淮山组培褐变。
　　1.2.3培养基的选择
　　理想的淮山培养基微环境（琼脂浓度、激素浓度、pH值等）具有显著的抗褐化能力。蔡建荣（2008）报道，外植体的褐化程度在加了0.7%琼脂的固体培养基中表现明显大于液体培养基，这是因为外植体溢出的有毒物质能够在液体中快速扩散而被稀释，短时间内无法形成一.个有效作用浓度点，淮山组培快繁时采用液体培养基能有效预防其褐化，成活率显著提高;但由于液体培养需要特别的设备，只适宜前期的诱导培养和初始培养材料较少时使用，并不适宜进行大规模的培养。
　　陈艳乐[30）（2004）研究表明，薯蓣多酚氧化酶（Poly-phenolOxidase，PPO）活性与褐变度呈正相关（r=0.909）。顾林等B（2006）以扬州菜山药为试材研究发现：山药中PPO酶活力随pH值升高而增强，到pH5.0时活力最高，然后下降，但到了pH7.0时又.上升，随后下降。可见，一定范围内pH值与淮山多酚氧化酶酶活力呈正相关或者负相关，与淮山褐化率具有相关性。潘娟等291（2009）报道，培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以抑制褐变，琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。廖明星等以韶关淮山为试验材料，发现淮山PPO对pH值的变化很敏感。pH值在2.5～4.5区间时，酶活力上升速率大，pH值在4.5～6.0区间的酶活力上升速率相对下降，而且酶活力数值变化不大。当pH值为6.0时，PPO酶活力达到最大，此后开始下降。王碧琴等以紫山药为研究对象，是将生长素NAA和分裂素6-BA组合使用，发现培养基中的高激素浓度有加剧外植体褐变的因素，在茎段诱导分化中培养基激素浓度越高褐化越严重。 　　综上所述，淮山组织培养时应充分考虑到培养基微环境中各个培养因素对褐化的影响。
　　1.2.4培养条件的选择
　　淮山组织培养受光照强度、温度等培养条件的影响。研究认为，在高温强光照下，外植体褐变程度增加;在低温暗处理下，淮山外植体的褐变率降低，褐变程度减小。李明军等⑤（2000）报道，淮山的零余子和叶片在光下褐化严重，而在暗处则褐化较轻或无褐化。尧俊英等报道，黑暗条件下外植体褐化较轻。潘梅等以薯块和茎段2种类型的外植体进行接种试验，结果发现，淮山组织培养温度在25C，光照强度为1500～20001x时外植体褐化较轻并能正常生长。
　　由于酚类化合物的合成和氧化涉及许多酶系统，而酶系统的活性受温度和光照影响。高温和光照会提高酶的活性，促进培养组织中酚类物质的氧化，加速外植体的褐变。笔者在组培快繁中发现，在低温、黑暗或遮光条件下，培养外植体可以降低多酚氧化酶的活性，减小酚类氧化，从而减少褐变;在不影响外植体正常生长的前提下，通过适当降低培养温度，控制适宜的光照条件，能够防止褐变。
　　1.2.5培养基中加入褐变抑制剂
　　褐变抑制剂包括防止酚氧化的抗氧化剂和吸收醌类物质的吸附剂。常用的抗氧化剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂，如抗坏血栓（Vc）、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、NaCl、柠檬酸，吸附剂如活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
　　YongqinChen，JinyuFan，潘娟等，王碧琴等分别对紫山药外植体培养过程中的褐化问题进行研究，结果表明：PVP、AC对茎尖、茎段外植体培养过程中有抑制或延迟褐变的效果;紫淮山采用茎段繁殖，并将3-5%的猕猴桃汁和0.1-0.5%活性炭加到初代培养、增殖培养褐生根培养的培养基中，即可有效地防止紫淮山组培过程中的褐化问题;以及MS培养基中添加150mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能有效抑制淮山茎段外植体分化过程中的褐变。我们在对“山格”淮山茎尖、茎段组织培养的过程中也发现类似结果。一般在茎尖、茎段接种1～2周左右，外植体插入培养基中的部位变褐变黑，切口部位渗出褐化物，并逐渐扩散，最后可能导致整个外植体变黑死亡。实验中加入Ve5.0mg/L或者AC1.0g/L均能达到较好抑制褐化效果，同时又不会影响分化率。因此，在培养基中添加褐变抑制剂对外植体褐化起到了良好的抑制作用。
　　2淮山褐变防止措施
　　淮山组织培养过程中，材料的褐变原因复杂多样，往往是多方面因素构成的。经过实验研究及查看文献资料，笔者总结了以下几条抑制淮山组培褐变的主要措施。
　　2.1外植体选择
　　选择适当的外植体材料，一般生长发育旺盛、分生能力強的培养物，其褐化程度明显较小。蔡建荣"（2008）报道，山药植株后期结出的零余子褐化程度最严重，而幼嫩茎节间部的茎段褐化程度较轻。因此，淮山的组织培养以茎段作为外植体较适宜。
　　2.2外植体预处理
　　蔡建荣”（2008）报道，淮山茎段外植体在接种前用100mg/LVc溶液浸泡30min，褐变现象能得到明显抑制。因为淮山茎段外植体吸收并附着的Ve在短期内将外植体伤口切面因酚类物质与氧气聚合产生的有毒醌类物质重新还原成为酚物质B3，34，从而暂时抑制有毒醌物质扩散到培养基中，在短时间内未能影响其他酶的活性，外植体保持正常生长状况。
　　2.3合适的培养基和培养条件
　　大部分研究认为，淮山较合适的光照强度为1500～2500lx，光照时数为l0-16h/d，pH为5.8～6.0，相对湿度一般要求在70%～80%之间，生长最适宜温度为25～28C4，培养室中一般以25C为宜。
　　2.4其他防止措施
　　转瓶周期也是影响外植体褐变的因素之一。我们在对“山格”淮山的组织培养过程中发现，茎段外植体接种后转瓶间隔时间不一样，褐化程度也不一样，其中以3d转瓶1次褐化程度最轻，随着转瓶时间的增长，褐化程度越来越严重。说明外植体在接种后的转瓶频率和次数与到外植体的褐化程度有关，适时切除培养物的褐化部分，适时转接，提高转接次数，以降低褐变程度变程度，提高外植体生长质量。
　　3结语
　　到目前为止，组织培养过程中的褐变现象研究已进行了几十年，积累了大量的资料，也提出了各种假说.但我们还是不能确切的阐述组织培养褐变的详细过程。通过对褐变现象研究状况的回顾和了解，我们可以得到以下共识：组织培养褐变是酚类物质被氧化的结果，其中PPO能促进褐变的发生。引起褐变的因素是复杂的，就内因来讲。外植体材料的生理状态、基因型、同一基因型的不同栽培条件、营养状况、生长部位和大小都会影响褐变的发生及发生程度;就外因而言，培养基的成分、外加激素的含量及比例、培养条件（温度、光照时间、光照强度、通气状况等）以及褐变抑制剂的种类等都会影响褐变的发生。褐变的发生往往是多种因素同时作用的结果，在导致褐变的诸多因素中，膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质的酶促氧化和组织发生褐变的关键.因此，深了解有关机制对于从理论上认识组织褐变，找到影响褐变的主导因子和克服褐变的有效方法.并从实践上防止褐变的发生，对解决组培生产过程中的褐变这一难题，促进组培技术的日臻完善，具有重要的理论和现实意义。
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