金叶龟甲冬青组培快繁技术的研究

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　　摘要：以金叶龟甲冬青（Ilex crenata）幼嫩茎段为外植体，设置不同的腋芽诱导培养基、增殖培养基、壮苗及生根培养基进行对比研究，建立金叶龟甲冬青组培快繁体系。结果表明，采用培养基MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L进行初代培养，腋芽诱导率达95%左右;利用培养基MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，丛生芽增殖系数高，幼苗生长健壮且色泽深绿;丛生芽接种于MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培养基进行壮苗培养，幼苗高度可达4.9 cm，生长健壮，色泽深绿;适宜的生根培养基配方1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L，生根率100%，根系生长健壮，色泽白色;经生根的试管苗移栽于园土（V）∶蛭石（V）∶泥炭（V）=2∶1∶1混合基质，加以合理管理，成活率可达95%。
　　关键词：金叶龟甲冬青（Ilex crenata）;组培快繁;诱导率;生根率
　　中图分类号：S687         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）04-0093-05
　　Abstract： To establish an efficient tissue culture system for rapidly propagating， taking young stem section of Ilex crenata ender as explant， different bud-induction medium， proliferation medium， robust seedling medium and rooting medium were conducted. The results showed that the optimal bud-induction medium was MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L and the induction rate of axillary bud was about 95%; The optimal medium for proliferation was MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，multiplication coefficient was high， seedling growth was strong with thick green; The optimal robust seedling medium was MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+sugar 30 g/L， the height of seedling reached 4.9 cm; The optimal rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+active-carbon 3.0 g/L， and the roots were strong and white in color， the rooting rate was 100%; The survival percentage of plantlets could be up to 95% through transplanted in the substrate containing garden soil， vermiculite and peat （2∶1∶1，V/V/V）.
　　Key words： Ilex crenata; tissue culture and rapid propagation; induction rate; rooting rate
　　金叶龟甲冬青（Ilex crenata）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青属彩叶植物，具有常绿、耐低温、植株低矮、紧凑等特点，其老叶色泽浓绿且具光泽，新叶叶色金黄，色泽亮丽。近年来，国内外绿化产业对金叶龟甲冬青的需求旺盛，因此应加快其繁殖速度，满足其日益增加的市场需求。金叶龟甲冬青的常规繁殖方法有扦插繁殖和嫁接繁殖，但繁殖速度较慢。组培繁殖可以提高金叶龟甲冬青的繁殖系数，加快推广应用速度，对丰富中国彩叶绿化树种有重要意义。
　　目前，国内外已有关于金叶龟甲冬青组织培养的部分报道[1-5]，但鲜见细胞分裂素ZT和6-BA对比分析、不同蔗糖浓度对试管苗的影响及添加活性炭对生根培养的影响等方面的研究。本研究从金叶龟甲冬青的外植体消毒、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等几方面着手，以细胞分裂素ZT和6-BA的对比分析、蔗糖浓度对试管苗的影响及活性炭的添加对生根的影响等方面进行研究，以期为金叶龟甲冬青优质种苗的快速繁殖提供技术支持。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试的金叶龟甲冬青材料由江苏绿苑园林建设有限公司苗木基地提供。
　　選择生长两年的健壮植株，再选择当年生带有腋芽的幼嫩茎段（长约2 cm）为外植体。
　　1.2  消毒灭菌
　　将外植体置于流水下冲洗1 h，加入适量的洗涤剂浸泡清洗3次，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒灭菌。具体操作为：先用75%乙醇浸泡20 s，用无菌水冲洗3次;转入0.1% HgCl2消毒8～9 min，无菌水冲洗3～5次后，用灭菌纸将外植体表面的水分吸干，接种于初代培养基上。
　　1.3  接种培养
　　1.3.1  初代培养  将经过消毒灭菌的金叶龟甲冬青外植体接种于初代培养基上，各培养基配方均在MS培养基中添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂，同时添加7.0 g/L琼脂和25 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每个配方接种24瓶，每瓶接种4个外植体。培养条件为：温度（20±2） ℃、光照强度1 000～1 500 lx、光照时间10～12 h/d。定期观察记录腋芽萌动情况，腋芽诱导率=（诱导出芽苗的腋芽数/外植体上总腋芽数）×100%。 　　1.3.2  增殖培养  选用优化的初代培养基进行初代培养后，将初代培养得到的芽苗切成带一个腋芽的长0.5 cm的茎段，接种在增殖培养基上，各培养基配方均是在MS培养基中添加不同種类和不同浓度的植物生长调节剂，同时添加7.0 g/L琼脂和25 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每个配方接种24瓶，每瓶接种3个茎段。培养条件为：温度（25±2） ℃、光照强度1 500～2 000 lx、光照时间12～14 h/d。定期观察记录丛生芽苗生长情况，计算增殖系数。增殖系数=增殖丛生芽总数/接种数。
　　1.3.3  壮苗培养  选用优化的增殖培养基进行增殖培养后，将产生的丛生芽切下后接种于壮苗培养基上，各培养基配方均在MS培养基中添加不同种类和浓度的植物生长调节剂及不同浓度的蔗糖，同时添加7.0 g/L琼脂，pH 5.6～5.8。每个配方接种21瓶，每瓶接种3个小苗。培养条件同增殖培养。
　　1.3.4  生根培养  当金叶龟甲冬青无根苗长至3～4 cm时，转移到生根培养基上培养，各培养基配方均在1/2MS培养基中添加不同种类和浓度的植物生长调节剂及不同浓度的活性炭，同时添加7.0 g/L琼脂、20 g/L蔗糖，pH 5.6～5.8。每个配方接种21瓶，每瓶接种3个小苗。培养条件同增殖培养。
　　2  结果与分析
　　2.1  初代培养对金叶龟甲冬青的影响
　　由表1可知，不同的初代培养基对金叶龟甲冬青腋芽的诱导产生不同的影响。细胞分裂素ZT对腋芽的诱导有明显影响，浓度过低时，腋芽诱导率较低，仅为38.5%;ZT浓度为0.5和1.0 mg/L时腋芽诱导率较高，分别为96.2%和94.5%，且诱导出的芽苗高度较高，分别为2.0和2.2 cm;当ZT浓度过高时，腋芽诱导率明显降低，芽苗高度亦明显降低。细胞分裂素6-BA对金叶龟甲冬青腋芽诱导有一定的影响，但诱导效果稍差于ZT，初代培养基6-BA浓度为0.5和1.0 mg/L时腋芽诱导率分别为76.6%和84.5%。根据不同的初代培养基对金叶龟甲冬青腋芽诱导的情况，初步判断，在同种浓度下ZT促进腋芽诱导的活性较6-BA高;适宜的ZT浓度利于金叶龟甲冬青腋芽的诱导，浓度过高或过低均不利于腋芽的诱导。本研究表明，金叶龟甲冬青适宜的初代培养基配方为MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，外植体在初代培养基上培养7～10 d，腋芽开始萌动，50 d后芽苗高度约2 cm。通过初代培养，腋芽诱导率达95%左右。
　　2.2  增殖培养对金叶龟甲冬青的影响
　　接种的茎段在增殖培养基上培养至10 d左右时有丛生芽长出，培养至40 d时观察记录丛生芽生长情况，发现不同培养基对金叶龟甲冬青的影响亦有所不同（表2）。其中，配方2的丛生芽增殖系数最高，达2.6，明显高于其他配方，丛生芽生长健壮，且色泽深绿。丛生芽增殖系数和高度位于其次的是配方1，丛生芽生长一般，色泽淡绿。配方3的丛生芽高度较高（1.2 cm），但增殖系数低，且丛生芽生长细弱，黄绿色。因此，适宜金叶龟甲冬青增殖培养的培养基配方为MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。丛生芽苗通过反复切割，每25～35 d将长出的丛生芽苗切下，继续继代培养1次，继代培养3次后，进行壮苗培养。
　　2.3  壮苗培养对金叶龟甲冬青的影响
　　选用优化的培养基进行继代培养后，将继代培养基上的丛生芽苗切下后接种于壮苗培养基上，由表3可知，丛生芽苗接种于不同的壮苗培养基上其表现有所不同。在同样的蔗糖浓度下，配方1、配方4和配方7相比较，配方4的幼苗生长良好;配方2、配方5和配方8相比较，配方5的幼苗生长良好;配方3、配方6和配方9相比较，配方6的幼苗生长良好。根据此初步判断，在蔗糖浓度不变的情况下，生长调节剂的浓度比例以ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L为宜。在同样的生长调节剂浓度比例下，配方1、配方2和配方3相比较，三者的幼苗生长状况均较差，且差异不明显;配方4、配方5和配方6相比较，配方4和配方5的幼苗高度差异不明显，但配方4的幼苗健壮度和色泽均明显差于配方5，配方6的幼苗高度明显低于配方5，且幼苗生长一般、色泽黄绿;配方7、配方8和配方9相比较，三者的幼苗生长状况均较差，且差异不明显。据此可初步判断，在同样的生长调节剂浓度比例下，蔗糖浓度以30 g/L为宜。综合在同样的蔗糖浓度和同样的生长调节剂浓度比例下各壮苗培养基配方幼苗的高度、健壮度和色泽等生长情况，适宜金叶龟甲冬青壮苗培养的培养基配方为MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，幼苗高度可达4.9 cm，生长健壮，色泽深绿。
　　2.4  生根培养对金叶龟甲冬青的影响
　　选用优化的壮苗培养基进行培养20～30 d后，把健壮的金叶龟甲冬青无根幼苗转移至生根培养基上进行培养，由表4可知，丛无根幼苗接种于不同的生根培养基上其表现有所不同。
　　15 d时统计生根率，不同的生根培养基其生根率不同，其中配方1、配方2和配方3的生根率均较高，三者差异不明显，配方2的生根率最高，达100%;配方4、配方5和配方6的生根率均较低，明显低于前3个配方。据此初步判断，金叶龟甲冬青的生根培养基中选用生长调节剂IBA和NAA合理配比时生根率较高，而选用生长调节剂IAA和NAA合理配比时生根率均较低，故金叶龟甲冬青的生根培养基应添加合理配比的生长调节剂IBA和NAA。
　　金叶龟甲冬青无根幼苗经生根培养基培养40～50 d后，观察记录根系生长状况，包括根系数量、根系长度、健壮度和色泽等指标。因配方4、配方5和配方6的生根率较低，这里仅对前3个配方的根系生长状况进行分析。配方1、配方2和配方3三者的根系数量差异不明显，其中配方2的根系数量最多、根系长度最长、且生长健壮、色泽为健康的白色;配方1和配方3的根系长度明显低于配方2，且这两个配方的根系生长一般或细弱、色泽呈现为不健康的淡黄色或黄褐色。据此可判断，金叶龟甲冬青的生根培养基中应添加适宜浓度的活性炭，活性炭浓度以3.0 g/L为宜，过高和过低均不利于根系的生长。综上所述，金叶龟甲冬青适宜的生根培养基配方为1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L，生根率100%，根系数量为5.4条/株，根系生长良好，长度3.6 cm、生长健壮，色泽为白色。 　　2.5  炼苗及移栽
　　金叶龟甲冬青在生根培养基中培养40～50 d后可进行炼苗移栽。金叶龟甲冬青组培苗炼苗可先在（23±2） ℃的温室内拧松瓶盖放置3～5 d，然后进行温床过渡移栽。过渡苗床（即温床）可建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2 m左右，床四周砌高30 cm，床底整平，栽培基质用园土（V）∶蛭石（V）∶泥炭（V）=2∶1∶1，栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用。移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将金叶龟甲冬青组培苗根部的固体培养基清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，并喷施稀释800～1 000倍的甲基托布津或稀释1 000倍多菌灵药液，以后每隔1周喷施1次，连续3～4次。移栽初期要特别注意保持苗床和空气湿度，湿度保持在90%左右，温度（23±2） ℃，前期应进行遮阴7～10 d;一般需全封闭管理7 d左右，根据情况在20 d左右可以逐步通风，并除去覆盖物。一般成活率可达95%。
　　3  小结与讨论
　　3.1  细胞分裂素对金叶龟甲冬青腋芽诱导的影响
　　不同的细胞分裂素对植物组培快繁的效果有所不同。张楠等[6]通过对大果黑果枸杞进行初代培养，发现ZT的培养效果明显优于6-BA，前者的腋芽萌芽率明显高于后者。刘晓娜等[7]对上西早生甜柿的快繁技术进行了研究，认为ZT 110 mg/L的快繁效果明显好于6-BA 510 mg/L。孟志霞等[8]研究表明，BA和ZT对金线莲增殖的作用差异较大，6-BA对金线莲芽苗增殖作用较ZT强。Jin等[9]认为，与ZT相比，6-BA是较适合蓝靛果组培的细胞分裂素。程广有等[10]研究ZT、6-BA对苦参组培快繁的影响，认为2种细胞分裂素诱导芽增殖时差异不显著。本研究与张楠等[6]、刘晓娜等[7]的研究结果相似，认为同种浓度下ZT促进金叶龟甲冬青腋芽诱导的活性较6-BA高。用细胞分裂素ZT来诱导金叶龟甲冬青腋芽，浓度应适当，且应与生长素NAA配合使用，ZT浓度过高或过低均不利于腋芽的诱导，金叶龟甲冬青适宜的腋芽诱导培养基为MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，腋芽诱导率达95%左右。
　　3.2  蔗糖对金叶龟甲冬青壮苗培养的影响
　　不同的蔗糖浓度对植物组培快繁产生不同的影响。闫斌等[11]认为NAA与蔗糖的含量对组培苗的壮苗生根具有显著影响，0.1 mg/L NAA与20 g/L蔗糖有利于组培苗的壮苗生根;蔗糖为30 g/L时，组培苗出现叶片卷曲，叶片较小。李云海等[12]研究表明，在有生长素存在的条件下，调整蔗糖的用量（品种ZH，20 g/L;品种BY-14，40 g/L），马铃薯壮苗效果更好，表现在促进根系发育和增加茎叶干物质的含量方面;蔗糖浓度过高，造成培养苗老化，不利于试管苗的快速生长和繁殖。魏梅娟等[13]证明了随着蔗糖浓度的增加，铁皮石斛原球茎增殖速度加快，当蔗糖30 g/L时原球茎生长状态最好，而当蔗糖浓度达40 g/L时，原球茎的生长受到抑制。本研究得出了与此一致的结论，发现在细胞分裂素和生长素适宜配比下（ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L），蔗糖应控制在适宜的浓度，蔗糖浓度过低或过高均不利于金叶龟甲冬青组培幼苗生长，金叶龟甲冬青壮苗培养时蔗糖适宜的浓度为30 g/L，低浓度蔗糖抑制试管苗生长，可能与提供的碳水化合物不足有关[12]，而高浓度的蔗糖使试管苗生长受到抑制可能与高浓度蔗糖产生较高的渗透压有关[13]。本研究认为适宜金叶龟甲冬青壮苗培养的培养基配方为MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，幼苗高度达4.9 cm，生长健壮、色泽深绿。
　　3.3  生长素和活性炭对金叶龟甲冬青生根培养的影响
　　生长素种类及其浓度对金叶龟甲冬青生根极为重要，生根培养时应选用合适种类和浓度的生长素。梁慧敏等[3]研究表明日本龟甲冬青生根培养基用1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.1 mg/L，生根率达100%。史云光等[5]筛选出金叶龟甲冬青生根的最佳培养基为1/2 MS+NAA 0.25 mg/L+IBA 0.75 mg/L，培养出的根系均匀、色白。李登中[4]認为金叶日本冬青适宜的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.6 mg/L，生根率达95%。朱志国[14]研究表明金叶日本冬青的再生植株在培养基1/2 MS+NAA 0.3 mg/L中不定根诱导效果较好。本研究与梁慧敏等[3]、史云光等[5]的结果有一定的相似之处，认为金叶龟甲冬青试管苗生根培养时应添加NAA和IBA两种生长素，且二者比例和浓度适当时试管苗生根率较高，而选用生长素IAA和NAA合理配比时生根率均较低，生长素适宜的浓度配比为NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L。
　　活性炭是组培苗生根时常用的一种附加物。不同的活性炭浓度对组培苗诱导生根的效果不同，因此选择适宜的活性炭浓度显得非常重要，浓度过高有抑制作用，浓度过低无效果。金香花等[15]认为树莓试管苗生根培养加入活性炭1.0 g/L，根多、根系健壮，活性碳浓度增加至2.0 g/L时对根系生长不利。陈雄伟等[16]研究表明添加3.0 mg/L活性炭明显提高鼎湖山紫背天葵生根质量。张素勤等[17]研究了活性炭对非洲菊不定芽生根诱导的影响，表明0.2%～0.3%活性炭能明显促进生根，缩短生根时间，增加了根数和根长。本研究与陈雄伟等[16]、张素勤等[17]的研究基本一致，表明在适宜的生长素配比（NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L）下，添加3.0 g/L活性炭生根率高，根系白色、且生长健壮;过高或过低均不利于根系的萌发和根系的生长。活性炭促进试管苗生根的原因可能是活性炭为根的生长发育营造了近似自然生长条件的黑暗环境，同时吸附培养基中有毒副作用的物质，降低盐离子浓度等[17]。 　　研究了金叶龟甲冬青组培快繁体系的建立，在腋芽诱导阶段对比了细胞分裂素ZT与6-BA的效果，认为ZT的效果优于6-BA;适宜的蔗糖浓度（30 g/L）利于金叶龟甲冬青壮苗培养;添加适宜浓度的活性炭（3.0 g/L）可以明显提高金叶龟甲冬青生根率、根系生长健壮。与扦插繁殖和嫁接繁殖等常规繁殖方法相比，本研究发现优化的金叶龟甲冬青组培繁殖方法：腋芽诱导培养基采用MS+ZT 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，用培养基MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L进行增殖培养，丛生芽在MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培养基中进行壮苗培养，在1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭3.0 g/L上生根培养，可以将其繁殖系数提高4～6倍，繁殖周期缩短至200～230 d，成活率可达95%。
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