欧李优系组培快繁技术研究

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　　摘要：为建立欧李（Cerasus humilis）优系离体快繁技术体系，对其离体培养过程中初代培养、增殖继代培养、生根培养3个阶段的培养条件进行了研究。结果表明，以其半木质化茎段为外植体，最适初代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，最适增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L水解乳蛋白，最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。
　　关键词：欧李（Cerasus humilis）;组织培养;快速繁殖
　　中图分类号：S662.3         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）06-0136-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.031           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： In order to establish the technical system of in vitro and rapid propagation of Cerasus humilis，the culture conditions of the first generation culture， the proliferation culture and the rooting culture were studied. The semi-lignified stem segments were used as explants. The results showed that the optimum medium of the first generation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，the optimum proliferation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L LH， and the optimum proliferation medium was 1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA.
　　Key words： Cerasus humilis; in vitro culture; rapid propagation
　　欧李（Cerasus humilis）又名钙果，属蔷薇科樱属，是中国特产的落叶小灌木。栽培品种果实含有丰富的活性钙元素，具有多种保健功能[1]。欧李抗寒、耐旱、耐贫瘠，是集营养、保健、绿化、美化于一身的多功能树种，具有广阔的市场前景[2]。通过组织培养进行离体快繁是繁殖欧李优良苗木的有效方法[3]。已有科研工作者对欧李的组织培养技术进行了研究[4-7]，但欧李种质资源变异类型多[8]，离体培养条件与品种、品系有一定关系[9，10]，通过离体快繁进行规模化生产技术体系尚未成熟。本研究以河北工程大学试验基地引自河北涉县的欧李优系为材料，通过初代培养，增殖继代培养，生根与移栽3个阶段的培养，确定了其完整的离体快繁体系，旨在为欧李规模化育苗提供技术支持。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料  试验材料为河北工程大学实习基地引自河北涉县山地的欧李优系植株，2015年至2016年以茎段为外植体，进行初代培养、增殖继代培养、生根培养3个阶段的试验研究。
　　1.2  试验方法
　　1.2.1  初代培养  以欧李半木质化茎段（距梢端第二个至第五个芽）为外植体，经过常规消毒后，剪切成单芽茎段，接种于各处理培养基，每瓶接种3～4个茎段。4周后统计各茎段腋芽的萌发情况与芽生长状况。处理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;处理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA;处理3，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;处理4：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA。
　　1.2.2  增殖继代培养
　　1）增殖培养基的选择。将初代培养的不定芽继代2次后，形成不定芽丛。将不定芽丛剪成含3～4个不定芽的小芽丛，转接到MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA、KT和IBA组合的继代培养基上。每瓶转接不定芽丛4～5个，每处理接种10～12瓶，3次重复。4周后观察、统计各处理培养基试管苗的平均增殖率和生长状况。处理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA;处理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA;处理3，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA;处理4，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA;处理5，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA;处理6，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.10 mg/L IBA。
　　2）附加成分的筛选。增殖期间，为了保证试管苗良好生长，培养基中添加不同种类和浓度的附加物，不添加为对照。每处理接种12～22瓶。4周后观察、统计各处理试管苗的平均增殖率和生长状况。基本培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA，處理1在基本培养基中加入100 mg/L水解乳蛋白，处理2在基本培养基中加入300 mg/L水解乳蛋白，处理3在基本培养基中加入50 mg/L马铃薯汁，处理4在基本培养基中加入100 mg/L马铃薯汁，处理5在基本培养基中加入2 mg/L AgNO3，处理6在基本培养基中加入5 mg/L AgNO3。 　　1.2.3  生根培养  当试管苗增殖到一定程度时，将不定芽丛剪成2～4 cm单芽（无根嫩枝），接入含有不同浓度和种类生长调节剂的生根培养基上，21 d后统计根系发生率和根系生长状况。处理1，1/2MS+0.2 mg/L IBA;处理2，1/2MS+0.5 mg/L IBA;处理3，1/2MS+0.5 mg/L IAA;处理4：1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。若无特殊说明，各培养阶段每处理的培养基中均含30 g/L蔗糖，5.5 g/L琼脂，pH 5.8。培养温度（23±2） ℃，培养室光照度3 000 lx。
　　2  结果与分析
　　2.1  生长调节剂对欧李茎段初代培养的影响
　　将表面灭菌的欧李茎段接入不同的初代培养基，1～2周左右腋芽开始萌动（图1），4周后的萌芽和生长状况见表1。从生长情况来看，虽然在较高浓度1.0 mg/L 6-BA的培养基上不定芽发生数量多，但是形成的不定芽有玻璃化发生。在较低浓度0.5 mg/L 6-BA的培养基上不定芽发生数量较少，但是不定芽生长良好。因此，选择最适的初代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA。
　　2.2  增殖培养条件的确定
　　2.2.1  生长调节剂对欧李试管苗增殖的影响  欧李试管苗在含有不同浓度生长调节剂组合的培养基上，生长状况与增殖率有明显不同（表2）。由表2可以看出， 处理1和处理2不定芽发生数量少，增殖率低。随着6-BA和IBA浓度的提高，增殖率有显著提高，但试管苗生长细弱，个别开始出现玻璃化现象（图2）。在保证试管苗增殖率的同时保证其健壮生长，选择处理5，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA，作为欧李试管苗增殖期间最适的生长调节剂组合，增殖率可达5.3（图3）。
　　2.2.2  附加物对欧李试管苗增殖的影响  在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA培养基中，添加不同种类和浓度的附加物，欧李试管苗的生长、增殖状况见表3。从表3可以看出，添加AgNO3培养基的试管苗茎尖、叶尖坏死状况均没有明显改善。在添加马铃薯汁的培养基中，试管苗茎尖变褐坏死状况略有减轻，但叶片明显变成黄绿色。添加水解乳蛋白的试管苗增殖率均比对照有所提高，同时茎尖及叶尖坏死现象明显减少，增殖率可达5.6。因此，最合适的添加物种类及浓度为水解乳蛋白300 mg/L。
　　2.3  不同培养基对试管苗生根的影响
　　欧李试管苗在含有不同种类和浓度生长调节剂的培养基上培养21 d，生根情况见图4和表4。结果表明，单独添加IBA和IAA的生根效果均不理想，添加IAA与IBA组合的生根效果较好，生根率高，根系数量多。
　　3  小结与讨论
　　3.1  小结
　　欧李最适初代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA，最适增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+300 mg/L水解乳蛋白，最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA。
　　3.2  讨论
　　以欧李优系春季萌发的半木质化茎段为外植体进行了初代培养、增殖继代培养与生根培养，建立了离体再生体系，实现了离体快繁。在初代培养阶段，虽然在不同初代培养基上，茎段有较高的腋芽萌发率，但是相对幼嫩的茎段（距梢端第2～3个芽），其腋芽萌发形成的枝条有玻璃化的趋势。相对老的茎段（距梢端第5～6个芽），腋芽萌发形成的枝条较充实，但污染率相对较高。因此，外植体的选择为顶芽以下4～5个节位的半木质化茎段。这与张秀丽[5]的报道顶芽以下4～8个节位上的腋芽最适合作外植体略有不同。初代培养过程中，4—5月取材时未发现外植体有褐化现象，这与黄立华等[11]在研究欧李取材时期及取材部位时，外植体有褐化的报道也有不同。这可能由于欧李品系不同，枝条的生长特性有差异，枝条及其不同节位的芽充实程度也不同。
　　在欧李试管苗增殖培养期间，6-BA与KT配合使用优于6-BA单独使用的效果，既能保证较高的增殖率，也能保证试管苗的正常生长，这与庄丽娟等[4]的报道一致。随着继代次数的增多，欧李试管苗出现了茎尖、叶尖坏死、玻璃化等现象。添加物合适浓度的水解乳蛋白有一定的缓解作用。同时，培养基中将蔗糖浓度由30 g/L提高到35 g/L时，玻璃化有减轻的趋势[12，13]。试验还发现，随着培养时间的延长，增殖继代2年以上的试管苗，试管苗的生长势逐渐减弱，增殖率有所降低，其机理有待进一步研究。
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