响应面法优化软枣猕猴桃组培增殖培养基

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　　摘要：目的：研究优化软枣猕猴桃的增殖培养基。方法：以软枣猕猴桃初代培养的不定芽为外植体，利用响应面法对其增殖培养基进行优化。在单因素的试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以6-BA、IAA、IBA为试验因子，植株再生频率为响应值，进行三因素三水平的试验设计。结果表明：三因素对植株再生频率的影响力大小为6-BA>IBA>IAA，最终得到的二元回归方程显示，一步成苗的培养基优化结果为MS+6-BA1.61mg/L+IAA0.55 mg/L+IBA0.33 mg/L。在此条件下，最佳再生频率预测值为7.27，实际操作结果为7.23，说明该方程预测与实际试验拟合度较好，该优化方案有实际意义和可行度。
　　关键词：响应面;优化;增殖系数;软枣猕猴桃
　　基金项目：吉林省重点科技攻关项目：编号20140204030NY，编号20140101271JC; 科技创新基金项目：编号（2017496）
　　中图分类号： Q949.758.2                              文献标识码：  A                   DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.02.024
　　 软枣猕猴桃（Actinidia arguta）为多年生落叶藤本，在我国主要分布在东北、华北、西北及长江流域，在吉林省主要分布在长白山区各县，是著名的经济野果[1]。野生软枣猕猴桃酸甜可口，富含营养成分，如黄酮及苷、氨基酸、有机酸、油脂及多糖、蛋白质、脂肪、维生素A、维生素C、叶绿素、果胶、胡萝卜素等[2，3]，还可加工成果脯、果酒、果汁等产品，有良好的食用价值。其根、茎、叶均可入药，可治疗消化不良、腹泻、呕吐和风湿性关节痛，有抗衰防癌的功效[4]，具有良好的药用价值和经济价值。
　　 软枣猕猴桃的常见繁殖方法有种子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖，但种子繁殖生长周期长，扦插和嫁接成活率低[5]，组织培养是快速繁殖大量植株并保留其优良性状的有效途径。目前，关于软枣猕猴桃的组培已有一些研究报道，在增殖阶段的研究中[6-9]，一般通过调整植物生长调节剂的种类及浓度，来筛选增殖系数更高的培养基，但增殖系数不够理想。增殖培养常用的植物生长调节剂有6-BA、IBA、NAA、IAA、KT等，但研究其中交互作用的文章未见报道。本次试验用响应面的研究方法，选用6-BA、IAA、IBA三种植物生长调节剂，以初代培养产生的不定芽为试验材料，探究最适宜软枣猕猴桃增殖的培养基，以及三种植物生长调节剂之间的交互作用，以期获得高于前人研究的增殖系数，在一定程度上优化软枣猕猴桃的快繁体系，为今后的相关研究提供理论实践基础。
　　1 试验材料与方法
　　1.1试验材料
　　 外植体为长白山野生软枣猕猴桃带芽茎段，于2017年5月采自吉林长白山地区，经消毒后接入诱导培养基：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L中，培养30d后，选取长势一致的不定芽为试验材料。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1单因素试验 为探究每种生长激素的不同浓度对外植体产生的影响，以MS为基本培养基，将6-BA、IBA、IAA分别设置5种浓度：6-BA（0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L）;NAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）;IAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）。将不定芽分别接种到培养基内，每个处理接10个不定芽，3次重复，30d后，统计增殖系数。增殖系数=培养30天后不定芽总数/接种的不定芽数。
　　1.2.2 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，应用响应面分析法，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以6-BA、IAA、IBA为试验因子，增殖系数为响应值，设计三因素三水平的优化试验，见表1，每个水平处理10个组培苗，培养周期为30d。
　　1.3 培养条件
　　 基础培养基为MS培养基，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，pH值为5.8～6.0。培养环境为温度（25±2）℃，光照强度2000lx，每天光照14h。
　　1.4 数据分析
　　 采用SPSS20.0和Design-Expert8.0.6软件对数据进行整理与分析。
　　2 结果与分析
　　2.1单因素试验结果
　　2.1.1 6-BA浓度对增殖系数的影响 由表2可知，6-BA对不定芽增殖的效果较显著，6-BA浓度为0.5、1.0mg/L时，产生的新芽叶片为嫩绿色，芽细弱矮小，长势不佳。随着浓度的升高，增殖系数随之升高，6-BA浓度为2.0mg/L时，达到了最佳增殖系数4.07，新生芽多，茎较粗壮，与其他处理有显著差异。但浓度超过2.5mg/L，增殖率下降，植株叶片边缘发黄，芽较细弱，长势不佳，可见6-BA浓度过高，对芽苗增殖分化有抑制作用。
　　2.1.2 IAA浓度对增殖系数的影响 由表3可知，低浓度的IAA对不定芽几乎无促进增殖的作用，新生芽极少，且茎段及叶片呈白绿色，长势不佳。IAA浓度越高，不定芽增殖系数越高，当IBA浓度为0.40mg/L时，最佳增殖率为2.37，芽苗翠绿色，長势健壮。
　　2.1.3 IBA浓度对增殖系数的影响 由表4可知，低浓度的IBA对不定芽增殖的促进作用较弱，芽呈嫩绿色，较细弱，随着IBA浓度的升高，增殖系数有所上升，新生芽渐多，且翠绿粗壮。IBA浓度为0.20mg/L、0.40mg/L时增殖系数无显著差异，新生芽较多，芽长势健康。IBA浓度为0.40mg/L时，增殖系数最佳，植株健壮，长势良好。 　　2.2 软枣猕猴桃增殖培养基的优化试验结果
　　2.2.1回归方程分析  以6-BA（X1）、IAA（X2）、IBA（X3）为自因素，以植株再生频率（Y）为响应值，设计了17组试验，5个中心试验，见表5。得到回归方程为：Y=7.04+0.69X1+0.33X2+0.51X3+0.20X1X2+0.12X1X3-0.10X2X3-1.76X12-1.03X22-0.51X32。R2=0.9694，说明试验值与预测值有较高的相关性，该回归模型的P值<0.0001，有极显著性。失拟项F值=0.0551>
　　0.05，不显著。说明该方程模型拟合度良好，试验误差小。表6中，X1、X3、X12、X22均呈极显著影响（P<0.01），X2、X32呈显著影响（P<0.05）。X1X2、X2X3、X1X3不显著。说明三种单因素对植物的增殖系数有显著影响，但三者之间的交互作用不显著。单因素对响应值的影响力大小为6-BA>IBA>IAA。
　　2.2.2响应面分析 等高线的形状可体现两因素交互作用的大小，圆形表示交互作用小，椭圆形则相反[10]。响应面的坡度变化可体现因素对响应值的影响力，坡度平缓说明影响力小，坡度陡说明影响显著[11]。由图1～图3可知，IAA与6-BA的曲面最陡，呈明显凸面，6-BA与IBA的曲面偏陡，IBA与IAA的曲面相对平缓。由此可知，三种因素的交互作用对响应值的影响力大小为X1X2>X1X3>X2X3。
　　2.2.3 模拟方程的验证试验 通过二次回归方程的分析可得出软枣猕猴桃增殖培养基中，三种植物生长调节剂的最佳浓度为：6-BA1.61mg/L，IAA0.55 mg/L，IBA为0.33mg/L，最佳增殖频率预测值为7.27。对该模型进行三次验证试验，每次处理10个不定芽，得出的三次结果为：7.3，6.9，7.5，平均结果为7.23。与方程预测值接近，说明该方程预测与实际试验拟合度较好，该优化方案有实际意义和可行度。
　　3 讨论
　　 增殖培养是组培试验中至关重要的阶段，植物生长调节剂的种类及浓度对不定芽的分化、增殖及组培苗的长势有着不同程度的影响[12.13]。本次试验以初代培养诱导出的不定芽为试验材料，通过调整6-BA、IAA、IBA三种植物调节剂的浓度，筛选出了适宜软枣猕猴桃增殖的培养基，最佳增殖系数为7.23。有研究用2mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA对软枣猕猴桃进行增殖培养，得到的最佳增殖系数为5.0[14]。也有研究用到0.8mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA，得到最佳增殖系数为4.84[15]。还有研究筛选的最佳增殖培养基为MS+BA 1.5mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1，增殖系数达4.5[16]。本次的試验结果明显高于上述研究，可能是因为所选的3种植物生长调节剂间相互作用对不定芽有更好的促进作用，其浓度经过Design-Expert8.0.6所得方程更为精确的计算，所以有了很好的增殖效果，高于部分前人的研究结果。
　　 在单因素的试验过程中，发现低浓度的植物生长调节剂对不定芽促进作用不显著，植株长势细弱，可能因浓度未达到其生长分化的需求量。但6-BA浓度为2.5mg/L，IBA浓度为0.8mg/L时，增殖率都有所下降，且试管苗叶片发黄卷曲，茎段细弱，长势不佳。这与前人研究结果一致，该研究发现，当添加的6-BA和IBA的浓度逐渐高于2.0mg/L和0.2mg/L 时，丛生芽增殖系数呈下降趋势[17]。说明高浓度的生长调节剂对试管苗的增殖分化促进效果减弱，抑制其增殖生长，在组培试验中，要控制好植物生长调节剂的浓度，才可得到最佳的试验效果。
　　 响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，通过对具有代表性的局部各点进行试验，回归拟合全局范围内因素与响应值间的函数关系，计算各因素最佳水平值[18]。相比于常用的正交设计，响应面法可分析几种因素间的交互作用，以达到较全面地反映各因素水平的效果。可在整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值，且实验次数少，节省了试验成本和时间。
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　　 作者简介：赵春莉，博士，副教授，研究方向：观赏植物资源引种驯化及繁殖技术。
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