基因型对粳稻花药培养效率的影响

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　　摘要 [目的]研究基因型对粳稻花药培养效率的影响。[方法]利用水稻花药培养技术，对16个农艺性状优良的粳稻品种进行了花药离体培养。根据其愈伤诱导率和绿苗分化率，筛选花药培养力强的优良粳稻品系。[结果]17y155适用为花药培养F1代的亲本，在水稻花药培养领域有很大的应用潜力。[结论]该研究对水稻花药培养高效体系的建立以及创制优良水稻新品系具有重要意义。
　　关键词 粳稻;花药培养;培养力;基因型
　　中图分类号 S 511.2+2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0039-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.011
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effects of Different Genotypes on Anther Culture Efficiency of Japonica Rice
　　GAN Quan， SONG Feng shun， TENG Bin et al
　　（Rice Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230001）
　　Abstract [Objective] To research the effects of different genotypes on anther culture efficiency of Japonica rice. [Method]Cultivation technology of anther culture was adopted to carry out the in vitro cultivation of 16 Japonica rice varieties with good agronomic characters. The high quality Japonica rice varieties with strong anther culture ability were screened according to the callus induction rate and green plantlet differentiation rate. [Result] 17y155 was suitable to be used as the parent material of anther culture F1 generation， which has great application potential in the field of anther cultivation. [Conclusion] This research is of great importance to the establishment of anther cultivation efficient system and new high quality rice lines.
　　Key words Japonica rice;Anther culture;Culture ability;Genotype
　　随着现代生物和农学技术的迅速发展，水稻花药培养作为植物细胞工程的主体技术之一，已经在水稻遗传育种上取得了突破性的进展[1]。自20世纪70年代以来，我国水稻花药培养技术已经与传统育种、转基因、化学物理诱变等相结合，成为水稻育种领域一个卓越有效的技术手段[2]。水稻花药培養技术在缩短育种周期、提高育种选择效率、混倍体用于植物细胞遗传等基础性研究、获得具有双亲优势特性的可育远缘杂种、提供丰富的染色体变异材料等方面具有的巨大优势[3-5]。
　　影响水稻花药培养效率的因素有很多，包括基因型、培养基成分、碳源、激素、接种时期、培养环境等，其中基因型是影响水稻花药培养力的最重要因素[6-7]。不同基因型植株的花药对培养力的反应不同，表现在愈伤组织诱导率、分化率、再生植株绿化率等。沈锦骅等[8]比对分析了各种类型的水稻材料，发现花药培养力由强至弱依次为糯稻、粳稻、籼粳杂交稻、籼稻，且不同材料之间差异很大。何涛[9]研究表明，愈伤组织的诱导和绿苗分化之间相关性显著，均由多基因控制的数量性状。分别将控制花药培养力和绿苗分化率的基因定位于1号染色体和10号染色体上。何平等[10]对110个DH（双单倍体）系进行花药培养力的QTL（数量性状位点）分析，得到了5个与愈伤组织诱导有关的QTL，分别位于6、7、8、10、12号染色体上;以及2个与绿苗分化有关的QTL，分别位于1、9号染色体上。苗立新等[11]研究发现，水稻杂种F1的愈伤诱导率、绿苗分化率介于双亲之间且偏向母本;如果父本和母本的花药培养力均较强，F1代的培养力也会较强。由此可见，筛选出花药培养力强且农艺性状优良的水稻品系对水稻育种效率的提高具有十分重要的意义。鉴于此，笔者利用水稻花药培养技术，对16个农艺性状优良的粳稻品种进行了花药离体培养，根据其愈伤诱导率和绿苗分化率的不同，筛选出了花药培养力强的优良粳稻品系，对水稻花药培养高效体系的建立以及创制优良水稻新品系具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　粳稻杂交F1代材料均采自于安徽省农业科学院水稻研究所试验田。16种粳稻组合包括稻花香/17y153、越光早熟/17y153、越光早熟/17y154、17y155/松5123、17y155/龙粳46、17y155/松粳22、17y155/龙粳16、17y155/绥化18、17y155/稻花香、17y155/东农425、17y155/龙泽6号、17y155/越光早熟、17y156/稻花香、17y156/越光早熟、越光早熟/17y191、稻花香/17y191。 　　1.2 田间取材与低温处理
　　不同时期花药的诱导率有显著的差异。长期实践发现，最佳的取穗时间为08：00—10：00，此时细胞处于旺盛分裂期。研究表明，处于单核靠边期的花粉形成愈伤组织的能力最强。田间取穗可根据器官形态指标判断花粉发育时期，具体表现为：穗包大而不破，剑叶叶枕距下叶叶枕一般为5～7 cm;颍壳颜色呈浅绿色，大小接近成熟的颍壳，硬度适中;花丝加花药长度小于颍壳的1/2、大于1/3。采穗时保留2片叶子，尽量减少水分的散失。剥取的幼穗用75%乙醇棉球擦拭消毒后，再用湿润的纱布包好，装入塑料袋并扎紧把口，以防止水分蒸发。随后将待接种幼穗放进8 ℃低温中处理10 d[12-13]。
　　1.3 花药接种
　　将幼穗以枝梗为单位分开，每15～20支为1束，浸入0.1%升汞中灭菌10 min，随后在超净工作台上用无菌水冲洗5次，并去除上部过嫩的穗及下部过老的穗。用镊子取出消毒好的幼穗，左手的食指和大拇指持小穗基梗，右手拿预先消毒好的剪刀剪掉1/2颍壳（不伤及花药），取出花药置于含有2，4-D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）的N6培养基上，每个培养基接种50～60枚花药。随后对接种后的花药进行黑暗培养，培养温度为26～28 ℃，相对湿度为78%～80%[12，14-15]。
　　1.4 分化培养
　　当花药在N6培养基中避光培养20～40 d后，花药会由淡黄色变成褐色，花药裂开并长出小水泡状物质，当愈伤组织直径发育至1～2 mm时为最佳的转育时期，此时将愈伤组织转移至附加IAA（吲哚乙酸）、KT（激动素）的MS培养基中进行分化培养，培养温度为25 ℃，相对湿度为60%，2 000 lx光照培养12 h/d[12，16]。
　　1.5 壮苗培养
　　分化培养10 d左右，愈伤组织会出现绿色斑点并逐渐长成绿芽、生根，长成绿苗，当高度至2～3 cm时，可利用附加IAA的怀特培养基进行壮苗培养。培养温度为25 ℃，相对湿度为60%，2 000 lx光照培养12 h/d。当绿苗长至3～4片叶且出现白根时，向培养基表面加少量的无菌水，炼苗3～4 d，随后移栽进行土培[12，17]。
　　1.6 数据统计方法
　　出愈率=愈伤组织块数/接种花药数×100%
　　绿苗分化率=分化绿苗愈伤组织块数/转移愈伤组织块数×100%
　　绿苗产率=出愈率×绿苗分化率×100%[18]
　　2 结果与分析
　　2.1 水稻花药培养情况
　　在培养初期，花粉沿着孢子体发育途径，经多细胞花粉形成愈伤组织，此时愈伤组织在花药内，为一团分生细胞组织，代谢旺盛且活力强（图1A）。随着愈伤组织的生长，早期出现的管状分子形成维管组织，随后逐渐形成厚角、厚壁等机械组织，成片集中分布，形成肉眼可见的愈伤组织（图1B）。当愈伤组织转移至分化培养基后，经过一段时间便开始根、芽原基的分化。水稻花粉愈伤组织分化根与芽的基础是分生组织。表层分生组织某处活动形成芽原基，散生分生组织活动形成根原基，由根、芽基进一步发展成根芽（图1C、D）。
　　2.2 不同水稻品系花药培养力的比较
　　不同水稻品系的花药培养力有显著的差异。该研究结果显示，粳稻组合17y155/龙泽6号组合表现出了较高的出愈率（24.76%）和绿苗分化率（25.07%）。同时，17y155/龙粳16、17y155/稻花香、17y155/松粳22、17y155/龙粳46都有较好的花药培养力（表1）。由此可见，17y155适用为花药培养F1代的亲本，在水稻花药培养领域有着很大的应用潜力。
　　3 结论与讨论
　　基因型在水稻花药培养中起到了至关重要的作用。提高水稻的花药培养力，最根本的办法是通过杂交等遗传改良手段，把高培养力基因导入到优良亲本或杂种中，通过改变基因型来提高材料的花药离体培养能力。目前常用的方法就是在已有的优良农艺性状的水稻品系中，筛选出有较高培养力的材料进行花药培养。该研究发现，17y155是适合进行水稻花药培养的优良品系。在后续的研究中，应不断地发掘新的高培养力的水稻花培材料，从而更好地发挥花药培养在育种中的优势。
　　基因型虽然是影响水稻花药培养力的关键因素，但培养条件同样重要。培养基是组织培养中最重要的基质和支撑培养物，选择合适的培养基对愈伤组织诱导和植株再生成功与否起着决定性作用。在水稻花药培养中，N6培养基对粳稻材料培养效果较好;合5培养基对籼稻具有特殊的培养效果[19-20]。愈伤组织诱导形成后，一般采用MS基本培养基;绿苗形成后，通常采用怀特培养基对再生植物进行壮苗[21]。虽然培养基种类繁多，但由于组织培养对基因型的依赖性，目前还没有一种花药培养基被普遍使用。
　　激素是植物在某特定部位形成的微量物质，不但对诱导植物花粉粒细胞分裂、生长及分化起到十分重要的作用，而且对植物组织培养成功与否也起到关键作用[22]。植物激素一般包括生长素和细胞分裂素2大类，包括2，4-D、IAA、KT等。这两类物质是培养基中的关键成分，其组成和配比不但可以影响花粉粒诱导形成愈伤组织，而且对愈伤组织形成来源也起到重要调控作用[23]。此外，许多研究发现，添加各种附加物对许多植物细胞和花药组织培养有提高愈伤组织诱导率和再生植株的作用，其中常见的附件物有脯氨酸、活性肽、水解络蛋白、丙氨酸、马铃薯提取液、椰子汁等，它们对提高水稻培养力也有较明显的促进作用[24-26]。
　　花药培养技术是目前创造纯合基因型和培养丰富变异材料的最有效手段，筛选培养力强的优良水稻品系、加强花药培养中关键技术和遗传机理的研究、使花藥培养与基因工程技术相结合、减轻对基因型的依赖性将为水稻花药培养的应用开创新局面。 　　48卷1期甘 泉等 基因型对粳稻花药培养效率的影响
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