HPLC法测定加味逍遥散复方中丹参酮ⅡA的含量
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摘要：目的 建立加味逍遥散复方中丹参酮ⅡA的测定方法。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶柱（inertsil ODS-3柱 250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸，进行梯度洗脱;检测波长：270 nm;流速：1.0 ml/min;柱温：20℃。结果 丹参酮ⅡA在0.0001～0.0005 μg范围内呈现良好的线性关系[r=0.9991，平均回收率为97.36%（RSD=1.38%，n=6）]。结论 本方法专属性强，准确度高，重现性良好，可用于加味逍遥散的质量控制。
关键词：加味逍遥散;含量测定;丹参酮ⅡA;HPLC
中图分类号：R286.0 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.052
文章编号：1006-1959（2020）02-0165-03
Abstract：Objective To establish a method for determination of Tanshinone ⅡA in Jiawei Xiaoyao San compound. Methods An octadecylsilane bonded silica column （inertsil ODS-3 column 250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used; Mobile phase： acetonitrile-0.1% phosphoric acid， gradient elution; detection wavelength： 270 nm; flow rate： 1.0 ml/min; column temperature： 20℃. Results Tanshinone IIA showed a good linear relationship in the range of 0.0001 to 0.0005 μg [r=0.9991， the average recovery was 97.36% （RSD=1.38%， n=6）]. Conclusion This method has strong specificity， high accuracy and good reproducibility， and can be used for the quality control of Jiawei Xiaoyao San.
Key words：Jiawei Xiaoyao San;Content determination;Tanshinone IIA;HPLC
逍遥散原方出自《太平惠民合剂局方》，具有调和肝脾，疏肝解郁，养血健脾的功效。加味逍遥散在此基础上加味而成，全方方药组成为：柴胡10 g、当归10 g、赤白芍15 g、党参10 g、炒白术10 g、生甘草6 g、丹参20 g、炒二芽各10 g、延胡索15 g、丹皮10 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、栀子6 g、炒积实15 g、陈皮15 g。杨超[1]研究发现，加味逍遥散复方可以增强原发性肝癌患者实体瘤稳定率、调节其肝功能并降低肿瘤标志物的浓度。处方中丹参为主药，丹参的主要成分为丹参酮ⅡA，现行质量标准测定不够全面，为保证该处方的内在质量，研究采用高效液相色谱法（HPLC法）对该处方中丹参主要活性成分丹参酮ⅡA进行定量研究。
1仪器与试药
1.1仪器 Agilnt1260型高效液相色谱仪;KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;GX-20型摇摆式中药粉碎机（上海荣舒工贸有限公司）;SHB-Ⅲ循水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;HH-8 数显恒温水浴锅（北京高信仪器设备有限公司）;调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）;YP50001电子天平（上海越平科学仪器有限公司）;SQP 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;RE52-99 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;TF881 数显鼓风干燥箱（吴江同丰烘箱电炉有限公司）;FYL-YS-50L恒温箱（北京福意联电器设备有限公司）。
1.2试药 丹参酮ⅡA对照品（批号：181120）购于上海融禾医药科技有限公司;乙腈为色谱纯;甲醇和磷酸为分析纯;水为自制重蒸水;其他试剂均为分析纯;加味逍遥散所需中药材购自广西中医药大学第一附属医院，经广西中医药大学中药鉴定教研室廖月葵教授鉴定丹参本品为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge）的干燥根及根茎。
2方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈为流动性A，0.1%磷酸为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;流速：1.0 ml/min;柱温：20 ℃;進样量：10 μl;检测波长：270 nm;理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于60000。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备 丹参酮ⅡA对照品溶液的制备：取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定后，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含丹参酮ⅡA 20 μg的溶液，即得。 2.2.2供试品溶液的制备 按处方量精密称取17味中药材饮片，加入8倍量的85%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，定容备用，取滤液2 ml进行3000 r/min离心 10 min，过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
2.2.3阴性供试品溶液的制备 按处方量精密称取除丹参以外的16味中药材饮片，加入8倍量的85%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，定容备用，取滤液2 ml进行 3000 r/min离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.3方法学考察
2.3.1阴性干扰试验 取“2.2”项下3种溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行分析测定，分别测定其峰面积。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱图保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，分离度均>1.5，并且阴性供试品无干扰峰出现，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算不低于60000。表明阴性样品中其他组分对丹参酮ⅡA的测定无干扰，见图1。
2.3.2线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μl进样测定峰面积，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，分别测定峰面积。以对照品的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得其回归方程。结果：丹参酮ⅡA回归方程Y=466.96X+48.848，相关系数r=0.9991。试验结果表明，丹参酮ⅡA进样量在4×10-3～2×10-2 μg，与峰面积呈现出良好的线性关系。
2.3.3精密度考察 精密的吸取同一对照品溶液 10 μl，按“2.1”项下色谱条件进行分析检测，连续进样6次，记录其色谱峰的峰面积，计算。结果：丹参酮ⅡA RSD为2.74%，试验结果显示仪器精密度良好。
2.3.4重复性考察 按“2.2.2”项下“供试品溶液的制备”方法分别制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下，精密吸取10 μl进样分析，测定丹参酮ⅡA的含量，其RSD分别为0.19%，结果显示该方法重复性良好。
2.3.5稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取10μl进样分析，按“2.1”项下色谱条件，测定丹参酮ⅡA的峰面积，其RSD为0.10%。结果显示该供试品具有稳定性良好。
2.3.6加样回收试验 精密量取已知丹参酮ⅡA含量的供试品溶液，共6份，按“2.2.1”项对照品溶液制备方法制备浓度为0.2 mg/ml的丹参酮ⅡA对照品溶液，分别精密加入浓度为0.2 mg/ml的丹参酮ⅡA对照品储备液4.0、8.0、12.0 ml，每个梯度平行两份。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算加样的回收率，结果表明丹参酮ⅡA的平均回收率为97.36%，RSD%为1.38%（n=6）。
2.4样品含量测定 按处方量精密称取3份上述17味药材饮片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析后，计算丹参酮ⅡA的含量76.93 μg/g（n=3）。
3讨论
丹参酮ⅡA具有显著扩张冠状动脉、减慢心率、修复心肌、改善微循环及血液流变性、降低血脂、抗感染等作用[2]。丹参酮ⅡA是处方中主药丹参的主要活性成分，其含量相对较高，现行质量标准测定不够全面，通过实验用HPLC法测定该方中丹参酮ⅡA的含量。参照2015年版《中国药典》一部丹参含量测定项下的提取方法，方中药物用8倍量的85%乙醇提取，提取丹参中丹参酮ⅡA较为完全。经试验，流动相为乙腈-0.1%磷酸（75∶25，V/V）等度洗脱;流速：1.0 ml/min;柱温：20℃;进样量：10 μl;检测波长：270 nm;测得结果比较理想，本法专属性强，操作方便，准确度高，重现性良好，可以用于加味逍遥散的质量控制。
參考文献：
[1]杨超.加味逍遥散联合经皮射频消融术治疗21例原发性肝癌（肝郁脾虚型）的临床疗效观察[D].湖北中医药大学，2012.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：105.
收稿日期：2019-10-12;修回日期：2019-11-02
编辑/肖婷婷
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