云南2种野生苜蓿资源对酸铝胁迫的响应分析

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　　摘  要：以云南2種野生苜蓿资源为材料，采用水培法研究酸铝胁迫对幼苗生长的影响。通过分析酸、铝单一及复合处理下幼苗根长、株高、生物量、根系活力、叶绿素和丙二醛含量、过氧化物酶和超氧化物岐化酶活性变化，比较2种苜蓿对酸、铝的耐性。结果显示：随着酸度的增加，天蓝苜蓿和紫花苜蓿幼苗的生长均受抑制，pH 7.0和pH 3.0处理对比分析，天蓝苜蓿在根长、株高、生物量、根系活力增幅比紫花苜蓿的增幅小;铝胁迫后，2种苜蓿在根长、株高、生物量、根系活力指标上均具有显著差异，且随着铝浓度的增大，受抑制越严重;酸、铝共同胁迫对2种苜蓿幼苗生长的影响大于单一胁迫对它的影响，pH 4.5，Al3+浓度300 mg/L时，2种苜蓿生长受抑最严重。酸、铝单一胁迫及复合处理均显著影响2种苜蓿，但天蓝苜蓿对酸、铝及酸铝的耐性优于紫花苜蓿。
　　关键词：苜蓿;酸铝胁迫;幼苗生长;抗氧化酶系
　　中图分类号：S551+.7      文献标识码：A
　　Analysis on Acid-aluminum Stress Response of Two Wild Alfalfa Resources in Yunnan
　　WU Lifang1， WEI Xiaomei1， ZHANG Lifang1， GUI Baolin2
　　1. College of Biological Resource and Food Engineering / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 655011， China; 2. Soil Fertilizer Workstation， Xundian County Agricultural Bureau， Xundian， Yunnan 650224， China
　　Abstract： Two wild alfalfa resources （Medicago lupulina， Medicago sativa） in Yunnan were used to study the effects of acid-aluminum stress on alfalfa seedling growth under water culture. The tolerance of the two alfalfa to acid and aluminum was compared by analyzing the changes of peroxidase and superoxide dismutase activities， root length， plant height， biomass， root vigor， chlorophyll content， malondialdehyde content under single and compound treatment of acid and aluminum. The seedling growth of the two alfalfas was inhibited significantly under acidity treatment. Comparation with pH 7.0 and pH 3.0， the root length， plant height， biomass and root activity of M. lupulina increased less than that of M. sativa. There were significant differences in the indexes for root length， plant height， biomass， root vigor between the two alfalfa resources under aluminum treatment. Seedling growth was seriously reduced with the increase of aluminum concentration. The influences of acidity and aluminum compound treatment on the seedling growth of the two alfalfa were greater than those of either stress in isolation. The growth of the two alfalfa was most severely inhibited under the pH 4.5， Al3+ 300 mg/L treatment. Under the conditions of acid， aluminum or acid-aluminum stress treatments， the tolerance of M. lupulina to acid， aluminum and acid-aluminum was better than that of M. sativa from the point of view of the indexes of growth or decline of seedling growth， physiological indicators， inhibition rate.
　　Keywords： alfalfa; acid-aluminum stress; seedling growth; antioxidant enzyme system 　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.009
　　我国酸性土壤主要分布于南方15省、市、自治区，总面积约占全国土地面积的21%[1]，且随着工业化、城镇化的加快，农业上化学肥料的使用，酸性土壤面积日愈扩大，因此土壤酸化及酸性土壤对植物生长发育的影响早已成为一个研究焦点问题。铝毒是酸性土壤上限制植物生长重要元素，常以不同的形式存在，其中离子态[Al3+、Al（OH）2+、Al（OH）2+]对植物的毒害最为严重。酸性土壤上铝毒对植物的伤害首先表现于根部，其会破坏根尖结构，抑制根系生长[2-3]，进而影响植株地上部分生长，最终影响产量和品质。
　　苜蓿（Medicago sativa）是发展畜牧业不可或缺的豆科牧草之一，在我国已有上千年的栽培历史，种植面积居世界第5位，约为世界的4.5%以上[4]。苜蓿喜中性或微碱性土壤（pH 6.7～7.5，pH<6.7，则土壤pH偏低），产量便会随pH的下降而迅速降低[5]。我国南方地区土壤普遍偏酸性，致使苜蓿的种植受到极大限制，虽通过引种与培育新品种得到初步试验推广，但想要使苜蓿在南方地区持续长足发展，亟需解决苜蓿与酸性环境的适应问题。国内外对苜蓿耐酸铝性从形态学、细胞学、生理生化代谢及分子水平上积累了许多研究成果，如Naras i m ha moorthy等[6]以二倍体苜蓿为材料，采用RFLP进行QTL分析，筛选出4個耐铝性的标记。Naras i m ha moorthy等[7]研究认为二倍体苜蓿M. sativa ssp. Coerulea具有较高的耐铝性，四倍体紫花苜蓿基因杂合性较高，对耐铝性品种选育有一定困难。李智燕[7]比较天蓝苜蓿与紫花苜蓿耐铝性及及其根瘤菌生长的耐酸铝性，认为天蓝苜蓿的耐铝性优于紫花苜蓿，其根瘤菌也较之紫花苜蓿根瘤菌有较强的耐酸铝性。杨丹娜等[8]研究单一酸、铝及酸铝共同胁迫对苜蓿种子发芽和幼苗生长的影响认为，共同胁迫的影响大于单一胁迫，pH<4.5、Al3+离子达50 mg/L以上时，苜蓿幼苗生长明显受抑。邱晓等[9]采用水培试验对27个紫花苜蓿品种的耐酸铝性评价认为，基因型不同，其对酸铝耐性不同，通过聚类分析得出巨人802、丰宝、WL525和萨兰多为耐铝性较好的品种。但不同研究者由于使用的材料不同，耐酸铝性评价指标体系不同，难以再现其实验结果，仍缺乏特异耐酸铝强的优质苜蓿资源。
　　云南分布有丰富的紫花苜蓿（M. sativa L.）、天蓝苜蓿（Medicago lupulina L）、毛苜蓿（M. edgeworthii Sirj. Ex Hand. Mazz.）和南苜蓿（M. polymorpha L.）4种野生苜蓿资源[10-11]。野生资源对当地气候及土壤条件有相对强的适应能力，近年来，云南由于发展畜牧业的需要，急需大量生产豆科牧草，科技研究者对本地野生苜蓿开展了许多研究工作[12-19]，然而对苜蓿耐酸铝性的研究积累仍欠缺。因此，本研究拟采用云南野生天蓝苜蓿、德钦紫花苜蓿为材料，研究酸、铝单一胁迫和复合胁迫下幼苗生长发育、生理代谢变化，以期能够为南方酸性土壤下耐酸铝苜蓿的选育提供理论依据，并为苜蓿在南方农业、畜牧业、草产业的可持续发展提供科学依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试天蓝苜蓿（M. lupulina L.）采自于云南罗平板桥镇，由罗平县工信局区力松馈赠，德钦紫花苜蓿（Medicago sativa L.）采自于云南迪庆德钦县金沙江干热河谷区。
　　1.2  方法
　　1.2.1  试验设计  挑选饱满、无损害的苜蓿种子，用0.1%的HgCl2消毒8 min后，无菌水冲洗5次后放入育苗盘于玻璃温室内进行育苗，待幼苗长出2片真叶后，每个苜蓿资源挑选长势一致的植株，用脱脂棉为固定物固定于有孔泡沫板上，适应培养2 d后进行酸、铝胁迫处理，每处理3次重复，Hoag land营养液+不同浓度酸、铝培养，期间每3 d换1次营养液，营养液以湿润棉花即可，共培养10 d后测定各项指标。
　　酸胁迫：用1 mol/L HCl调节Hoagland营养液pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。
　　Al3+胁迫：用AlCl3为铝源，Al3+浓度为0、50、100、200、300、400、500 mg/L。
　　酸铝胁迫：pH 4.5对应Al3+浓度为0、50、100、200、300 mg/L。
　　1.2.2  测量指标与方法  根长、株高：分别测定胁迫前、后的株高和根长，计算相对根长和株高。相对抑制率=（对照?胁迫处理）/对照×100%。
　　生物量：从每个处理中随机取出10株，电子天平上称量幼苗的重量，计算单株均值。
　　根系活力采用TTC比色法测定[20]，叶绿素含量采用乙醇提取法[20]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[21]、过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[21]、超氧化物岐化酶（SOD）活性采用NBT法测定[21]。
　　1.3  数据处理
　　利用Excel7.0、SPSS19.0软件对数据进行整理与方差分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  酸胁迫对2种苜蓿资源幼苗生长的影响
　　2种苜蓿资源幼苗生长对酸的胁迫响应见表1。从表1可知，天蓝苜蓿和紫花苜蓿其幼苗根长、株高、生物量及根系活力随pH的降低而降
　　低，各处理间均具有显著性差异。pH 7.0时2种苜蓿各测定指标均获得最大值，pH 3.0时各指标值最小，与pH 3.0对比，pH 7.0天蓝苜蓿根长、株高、生物量、根系活力增幅分别为262.5%、225.0%、35.4%和165.3%，紫花苜蓿增幅分别为281.1%、316.0%、37.9%和187.3%。2种苜蓿相比较，pH 7.0时根长、株高、生物量其变化幅度不大;pH≤6.0，相同处理中，天蓝苜蓿根长，株高和生物量均比紫花苜蓿要高;同一处理中根系活力天蓝苜蓿均比紫花苜蓿强。其说明2种苜蓿对酸胁迫均表现敏感，紫花苜蓿对酸更加敏感。 　　2.2  酸胁迫对2种苜蓿资源生理生化的影响
　　天蓝苜蓿和紫花苜蓿幼苗叶绿素含量随pH降低而下降，不同pH处理下均达到显著性差异（表2）。天蓝苜蓿幼苗中MDA含量随pH的降低而上升，而pH 4.0时紫花苜蓿中MDA含量最高。MDA含量是植物膜系统对逆境的响应反映，含量越高，膜受损越大。POD活性随pH降低而下降，SOD活性随pH下降而上升，各处理均具显著性差异。与pH 3.0处理相比，pH 7.0处理天蓝苜蓿叶绿素含量增幅达113.2%，POD活性增幅为36.6%，MDA含量降幅为37.0%，SOD活性降幅为57.0%;而紫花苜蓿叶绿素含量增幅达141.9%，POD活性增幅为50.6%，MDA含量降幅为65.4%，SOD活性降幅为49.9%。
　　综上所述，不同酸胁迫下，天蓝苜蓿和紫花苜蓿幼苗生长及生理生化变化基本表现为：随酸性增加其抑制作用越明显。在所测定的8个指标中，中性（pH 7.0）与强酸（pH 3.0）相比，7个指标中天蓝苜蓿的增幅或降幅比紫花苜蓿的测定值变化大，说明紫花苜蓿幼苗对强酸处理更为敏感。
　　2.3  铝胁迫对2种苜蓿资源幼苗生长的影响
　　不同浓度铝胁迫对2种苜蓿幼苗生长的影响见表3。由表3可知，铝胁迫均会抑制2种苜蓿的根长、株高、生物量及根系活力，受抑制程度随铝浓度的增加而增减，铝离子为0～400 mg/L之间时，各处理间均具有显著差异。与对照（Al3+为0 mg/L）相比，Al3+为500 mg/L天蓝苜蓿根长、株高、生物量与根系活力4个指标上，其抑制率分别为72.5%、67.9%、71.2%和67.50%，紫花苜蓿其抑制率分别为77.1%、71.2%、71.9%和77.4%。比较而言，紫花苜蓿高铝胁迫时，抑制率比天蓝苜蓿要高。
　　2.4  铝胁迫对2种苜蓿资源幼苗生理生化的影响
　　不同浓度铝胁迫对2种苜蓿幼苗生理生化的影响见表4。从表4可知，不同铝浓度处理对2种苜蓿在叶绿素含量，MDA含量、POD及SOD活性均产生不同影响，其叶绿素含量和SOD活性随铝离子浓度的增加而下降，MDA含量和POD活性随铝离子浓度的增加而升高。其中，与对照相比，Al3+为500 mg/L处理天蓝苜蓿叶绿素含量抑制率为74.6%，POD活性抑制率为31.8%，MDA含量增幅为79.4%，SOD活性增幅为61.1%;而紫花苜蓿叶绿素含量抑制率为80.2%，POD活性抑制率为30.9%，MDA含量增幅为43.3%，SOD活性增幅为55.6%。
　　综上所述，不同铝浓度处理时，天蓝苜蓿和紫花苜蓿幼苗生长及生理生化变化基本表现为：随铝浓度增加其抑制作用越明显。在高铝胁迫下，8个测定指标中，紫花苜蓿根长、株高、生物量、根系活力、叶绿素含量的抑制率比天蓝苜蓿高，丙二醛含量、SOD和POD活性表现相反趋势。MDA含量、SOD和POD活性表现相反趋势。
　　2.5  酸铝胁迫对2种苜蓿资源幼苗生长的影响
　　当pH为4.5时，不同浓度铝胁迫对2种苜蓿幼苗生长的影响见表5。由表5可知，幼苗根长、株高、生物量及根系活力随着铝浓度的增加而降低，其天蓝苜蓿抑制率分别为81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分别为84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。从比较看出，高铝胁迫时紫花苜蓿抑制率比天蓝苜蓿要高，说明天蓝苜蓿相较紫花苜蓿耐酸铝胁迫。
　　2.6  酸铝胁迫对2种苜蓿资源幼苗生理生化的影响
　　当pH为4.5时，不同浓度铝胁迫对2种苜蓿幼苗生理生化的影响见表6。由表6可知，酸铝胁迫处理对2种苜蓿在叶绿素含量，MDA含量、POD及SOD活性均产生不同影响，其叶绿素含量随铝离子浓度的增加而下降，MDA含量随铝离子浓度的增加而升高，而POD和SOD活性在天蓝苜蓿与紫花苜蓿之间变化有所不同，天蓝苜蓿POD和SOD活性低酸铝胁迫（Al3+ 50 mg/L）先增后降，紫花苜蓿POD活性随铝浓度的增加先增后降，SOD活性随铝浓度的增加而下降。与对照相比，Al3+ 300 mg/L处理天蓝苜蓿叶绿素含量抑制率为77.3%，POD活性抑制率为31.7%，SOD抑制率为35.7%，MDA含量增幅为47.4%;而紫花苜蓿叶绿素含量抑制率为84.4%，POD活性抑制率为39.9%，SOD抑制率为47.8%，MDA含量增幅为48.1%。
　　3  讨论
　　酸铝胁迫时，根系是最先作用的器官，根系感受逆境胁迫信号后，通过激发信号分子转导后，调节自身抗氧化酶类及蛋白表达，调整自身生理代谢适应逆境，因此，根系对环境的适应能力能直观反映对酸、铝的耐受性，如果根系生长受抑，其相應的株高、产量等均会受到影响。本研究中，2种苜蓿资源在酸胁迫下幼苗生长均受到影响，但天蓝苜蓿的生长优于德钦紫花苜蓿，说明一定酸度处理下，天蓝苜蓿对酸的耐受性优于紫花苜蓿。2种苜蓿在测定的各指标中，根系长度、根系活力、株高、生物量、叶绿素含量、POD活性随pH的降低而降低，pH 3.0时受抑最严重，pH 7.0生长最好。这一研究结果与杨丹娜等[8]、李剑峰等[22]对紫花苜蓿酸胁迫强酸严重抑制，而弱酸有促进发芽及幼苗生长的研究结论不一致。MDA含量在2种苜蓿之间稍有变化，天蓝苜蓿中含量随pH的降低而上升，而紫花苜蓿中pH 4.0时含量最高，这可能是由于紫花苜蓿对酸的耐受性为4.0时已到一定极限。
　　单一铝胁迫下，根据实验数据可知，不同浓度铝胁迫下，天蓝苜蓿和紫花苜蓿幼苗根长、株高、生物量及根系活力均受到不同抑制，不同处理间均有显著差异。与对照相比，同一测定指标中，Al3+ 500 mg/L紫花苜蓿的抑制率高于天蓝苜蓿，说明天蓝苜蓿耐铝能力高于紫花苜蓿。
　　酸铝复合处理时，2种苜蓿幼苗根长、株高、生物量及根系活力随着铝浓度的增加而降低，与对照相比，天蓝苜蓿抑制率分别为81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分别为84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。天蓝苜蓿叶绿素含量抑制率为77.3%，POD活性抑制率为31.7%，SOD抑制率为35.7%，MDA含量增幅为47.4%;而紫花苜蓿叶绿素含量抑制率为84.4%，POD活性抑制率为39.9%，SOD抑制率为47.8%，MDA含量增幅为48.1%。比较单一酸、单一铝及酸铝共同胁迫，不难发现单一酸处理对苜蓿形态指标的影响没有单一铝影响大，而酸铝共胁迫其抑制作用最为明显，其研究结论与杨丹娜等[8]的研究一致。有所差异的是杨丹娜等[8]研究认为pH低于6.0才会有毒害作用，而本研究中pH低于7.0均会产生抑制。逆境胁迫时，植物体内MDA含量变化反映了细胞膜受损程度，POD和SOD活性的高低呈现出抵抗逆境的程度[23]。本研究中，酸度越高，铝浓度越高，MDA含量越高，POD活性越低，SOD活性随着胁迫强度的增加均有明显上升趋势，从评价的8个指标分析，天蓝苜蓿对酸铝的耐受性比紫花苜蓿要强。 　　参考文献
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