一例鸭病毒性肝炎与圆环病毒混合感染的实验室诊断
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中圖分类号：S858.324.4+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）4-0034-03
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的，以肝脏病变为主要特征的一种高度致死性传染病，主要侵害1月龄以内的雏鸭[1]。DHV主要包括鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）、鸭星状病毒1型和2型，其中DHAV属于小RNA病毒科的禽肝炎病毒属[2]。根据中和试验检测结果，DHAV可分为3个血清型：DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前，国内流行的主要为DHAV-1和DHAV-3毒株，其中DHAV-1为DHAV的经典毒株，而DHAV-3是分离的DHAV新型毒株[3]。近年来，我国DHAV-3的出现以及DHAV-1和DHAV-3在一些地区的共流行，已经给我国养鸭业造成重大损失。
鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，是近些年新发现的禽类病毒病原。根据病毒基因组序列可以分为I型和II型，目前在我国主要养鸭地区流行毒株以I 型为主[4]。DuCV可以感染各日龄和品种鸭，也可以感染鹅。DuCV主要侵害免疫系统，导致机体免疫力降低而易于继发其它疾病，与其它鸭病毒混合感染普遍[5]，造成生产上诊疗困难，耽误最佳治疗时期。
近期实验室接诊了某养殖公司送检的疑似鸭病毒性肝炎病例，通过实验室诊断确定为DHAV-3和DuCV-I混合感染，现报道如下，以期为该地区鸭病毒性肝炎和鸭圆环病毒的防控提供有效参考。
1 材料与方法
1.1 病料采集与处理 发病鸭来自山东地区某养鸭场30日龄樱桃谷鸭，表现精神萎靡，采食下降，死亡率0.25%左右。剖检可见肝脏条纹状出血，肾脏肿胀明显，脾肿大，少量心包积液，有的胰腺点状出血。采集病死鸭肝脏、脾脏和胰腺等作为病料，混合后以1：5比例加入灭菌生理盐水，使用组织匀浆机将病料打碎形成混悬液，置-80℃冻融2次，4℃ 8000g离心15min，取上清进行实验室PCR检测。
1.2 PCR鉴定
1.2.1 组织核酸提取 处理好的病料上清按照试剂盒（Axyen）说明书提取病毒核酸，并于-20℃保存备用。
1.2.2 引物设计和PCR检测 利用本实验室设计的针对禽流感病毒（AIV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭呼肠孤病毒（DReoV）、鸭细小病毒（DPV）和鸭圆环病毒（DuCV）等常见病原的引物，通过PCR或RT-PCR方法进行病毒核酸检测。
PCR反应体系25μL：2×Taq PCR StarMix 12.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，DNA模板2μL，超纯水9.5μL。扩增条件：94℃预变性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 90s，35个循环;72℃延伸5min。
RT-PCR反应体系20μL：2×One Step Mix 10μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，One Step Enzyme Mix 1μL，超纯水5μL，RNA模板3μL。扩增条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 30s，35个循环;72℃延伸5min。
PCR产物用1.5%琼脂糖电泳进行检测后，凝胶成像系统观察并记录结果。并将PCR阳性样品进行测序。
2 结果
2.1 病理解剖与病变观察 剖检6只病死鸡，主要眼观病理变化为肝脏条纹状出血，见图1;肾脏肿大呈花斑状，见图2。
2.2 实验室PCR检测 病毒核酸检测结果显示，DHAV-3为阳性，电泳条带大小为240bp;DuCV-I为阳性，电泳条带大小为460bp;其他常见病毒均为阴性。结果见图3。
3 讨论
近年来随着养鸭业的发展，规模化密集养殖模式的增多，鸭疾病爆发的危害更加严重。由于免疫压力等因素的影响，鸭甲型病毒性肝炎呈现出新的流行态势。1963年在中国首次报道了该病[6]，随后，国内越来越多的鸭肝炎病毒毒株（DHAV-1）被发现。2002年，苏敬良等报道了一例新型鸭肝炎病毒（DHAV-3），且DHAV-1和DHAV-3之间交叉保护力很差[7]。何冉娅等对华南地区分离的18株DHV进行病原学检测发现有15株为DHAV-3[8]。Fu等对28份死亡雏鸭的肝脏样品进行核苷酸序列分析和血清型分析，分离到15株DHAV-3[9]。
目前，DHAV-3已成为引起我国鸭肝炎的主要病原之一，且流行地域分布存在不断扩大的态势。目前，没有商品化的疫苗用于DHAV-3的防控，虽然DHAV-1和DHAV-3抗体可以用于鸭甲型病毒性肝炎治疗，但实际生产中，DHAV仍时有发生，这可能与混合感染其他鸭病毒有关。
在本病例中，除DHAV-3以外还检测到DuCV-I型病毒。DuCV最初在德国发现，随后在美国、韩国、中国等国家发现并流行[10]。鸭圆环病毒主要引起鸭生长发育不良，生产性能下降，免疫器官萎缩，淋巴组织受损，引起免疫抑制，通常与其他病原体共同感染使疾病进展更加复杂[11]。
DuCV感染阳性率高低不一，近年来我国山东、福建、广东养鸭大省的感染情况日趋严重[12]。DuCV病毒分离较困难，因此没有商品化的疫苗产品可供使用。该病以预防为主，养殖场应采取严格的生物安全手段，严防鸭圆环病毒病的发生和流行。 鸭病毒性肝炎和鸭圆环病毒病均是当前危害养鸭业的重要传染病。由于DuCV感染普遍存在，近来DHAV病例经常能够同时检测到DuCV，因此推测这可能是DHAV防控失败的原因之一。但是，由于缺乏实验证据，DHAV和DuCV 是否能够协同致病以及其协同致病机理仍需进一步研究。
参考文献：
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[7] 苏敬良，黄瑜，贺荣连，等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定[J].中国兽医科技，2002， 32（1）： 15-16.
[8] 何冉娅，于淼，张玉玲，等.2007-2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VPl基因变异分析[J]. 中国动物传染病学报，2010，18（1）：7～15.
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[11] 洪炳发.一例鸭圆环病毒感染的诊治[J].中国畜禽种业，2019，15（12）：171-172.
[12] 陶广朋.鸭圆环病毒的流行与防控[J].中国畜禽种业，2019，15（09）：192.
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