蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立

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　　摘要 蚜虫中具有多种共生菌，使用常规PCR对它们进行检测，耗时耗力，而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测。沃尔巴克氏菌Wolbachia pipientis、杀雄菌属共生菌Arsenophonus和蚜虫U型共生菌Regiella insecticola是蚜虫中常见的3种共生菌。本研究针对沃尔巴克氏菌、杀雄菌属共生菌和蚜虫U型共生菌，分别选择以wsp基因、yaeT基因和gltA基因作为靶标，进行了多重PCR引物的设计和扩增体系的优化。结果显示，本研究建立的多重PCR体系在检测3种蚜虫常见共生菌时，具有较高的扩增特异性、准确性和直观性及较高的检测灵敏度，共生菌的最低检测浓度为104拷贝/μL，远低于共生菌在蚜虫1龄若虫总DNA中的浓度（108拷贝/μL），可以完全满足蚜虫共生菌检测工作的需要。
　　关键词 沃尔巴克氏菌; 杀雄菌屬共生菌; 蚜虫U型共生菌; 多重PCR
　　中图分类号： S 433.3  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019069
　　Abstract Aphids harbor many bacterial symbionts. Although conventional PCR is universally used in the detection of aphid bacterial symbionts， however， it is a time-consuming way when multiple aphid bacterial symbionts should be detected in the same sample. Previous researches revealed that the multiplex PCR had high efficiency in the multiple bacteria detections. Wolbachia， Arsenophonus and Regiella insecticola are the three universal bacterial symbionts in aphids. In this study， we employ three protein coding genes， wsp， yaeT and gltA， as targets to design the multiplex PCR primers and establish an optimized detection system. The results showed that the multiplex PCR system established in this study had high amplification specificity and accuracy in the detection of the three aphid bacterial symbionts. Moreover， the minimum detection concentration of symbiotic bacteria was 104 copies/μL， lower than that of that in the total DNA of the first instar aphid， 108 copies/μL， indicating that the multiplex PCR system also had the high sensitivity in the bacterial symbionts detection， which will fully meet the requirements in the detection of aphid bacterial symbionts.
　　Key words Wolbachia pipientis; Arsenophonus; Regiella insecticola; multiplex PCR
　　 蚜虫属半翅目，胸喙亚目Sternorrhyncha，是一类重要的经济害虫[1]。蚜虫主要以植物韧皮部的汁液为食，而植物韧皮部汁液是一类营养极其不均衡的食物，富含碳水化合物，却缺少动物生长发育所必须的氨基酸[2]。蚜虫和细菌的关系密切，几乎所有的蚜虫中都含有一种可遗传的共生细菌——Buchnera aphidicola[3]。研究表明，B.aphidicola可以合成蚜虫生长发育所需的氨基酸，它和蚜虫寄主之间具有专性共生的关系[4-5]。相对于专性共生菌，蚜虫中还存在另外一类具有垂直传播能力的共生细菌，由于它们和蚜虫之间不存在专性共生的关系，因此被统称为蚜虫兼性共生菌。蚜虫兼性共生菌具有多样化的生态学功能，如增强蚜虫对高温的忍耐[6]，增强蚜虫对寄生蜂寄生和真菌感染的抵抗能力[7-8]，扩大蚜虫的寄主范围[9]等。
　　蚜虫共生菌对生存环境要求苛刻，基本上都不能在蚜虫体外进行纯培养，因此目前已知的蚜虫共生菌都是通过使用分子手段进行鉴定的[10]。共生菌已经被认为是蚜虫体内另外一种遗传变异的来源[11]，以其为对象开展的蚜虫种群遗传结构分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌作为介体开展对蚜虫的生物防治都是目前国内外研究的热点[11-13]。而对蚜虫中共生菌的物种进行快速、准确的鉴定，是开展上述研究工作的前提。
　　
　　在前期的研究工作中，研究者基本上都是使用常规PCR检测方法，合成单对引物对单个蚜虫共生菌进行鉴定，而1次PCR扩增只能在单个样品中检测到1种共生菌。但是，在实际调查研究中，往往需要同时在多达几百个，甚至上千个蚜虫样品中检测多种共生菌。因此，使用常规PCR开展蚜虫共生菌物种的多样性检测，需要耗费大量的人力物力。而依托于多个细菌物种基因设计和优化的多重PCR体系，可以一次在单个样品中检测多个细菌物种，是一种高效的分子检测方法，并已经广泛应用在环境微生物和病原微生物检测中[14-16]。沃尔巴克氏菌Wolbachia pipientis、杀雄菌属共生菌Arsenophonus和蚜虫U型共生菌Regiella insecticola是蚜虫中常见的3种共生菌[17-19]。本研究中，针对它们设计和优化了一套能快速、准确、直观并兼有高灵敏度的多重PCR反应体系，可以通过一次多重PCR扩增，揭示待测蚜虫中3种共生菌的感染情况，为今后开展蚜虫共生菌的检测工作提供了极大的便利，并节省大量的成本。 　　1 材料和方法
　　1.1 供试蚜虫材料
　　使用的蚜虫材料是2013年4月采集自河南郑州、原阳麦田的麦长管蚜（又称荻草谷网蚜）Sitobion miscanthi和禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi，随后在实验室进行单雌饲养，检测其共生菌感染情况。建立了室内单独感染沃尔巴克氏菌和杀雄菌属共生菌的禾谷缢管蚜种群;单独感染蚜虫U型共生菌的麦长管蚜种群;未感染共生菌的麦长管蚜对照种群。
　　1.2 蚜虫样品总DNA的提取
　　取出饲养的单头蚜虫，在75%乙醇中进行多次漂洗以除去蚜虫表面菌污染，然后在无菌水中浸泡1～2 h去除乙醇。使用灭菌的移液器枪头对蚜虫样品进行研磨，然后使用动物组织和细菌通用DNA提取试剂盒进行总DNA的提取（EasyPure Genomic DNA Extraction Kit，北京全式金生物技术有限公司），提取后的蚜虫样品总DNA置于4℃保存备用。
　　1.3 PCR引物设计
　　使用3个蛋白质编码基因作为靶标开展相关的多重PCR引物组合的设计。wsp基因编码外膜蛋白，是国际上对沃尔巴克氏菌进行检测和分型的通用基因[20];yaeT基因编码外膜蛋白组装因子，已经广泛应用于杀雄菌属共生菌株系的多基因分型[18];gltA基因编码细菌中的柠檬酸合成酶，已经成功用于蚜虫U型共生菌的检测[21]。本研究设计的引物序列见表1。
　　1.4 常规PCR
　　1.4.1 引物浓度梯度筛选
　　PCR扩增反应体系为50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游单基因引物各1～2.0 μL，DNA模板1 μL，25 mmol/L的 MgCl2 3 μL，去离子水补至50 μL。
　　PCR扩增反应条件为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。
　　1.4.2 克隆和测序
　　目的片段使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金生物技术有限公司）进行纯化回收;将回收片段与pEASY -T1 Simple Cloning Vector（北京全式金生物技术有限公司）按照载体说明书要求的体系进行混合，在25℃连接10 min，随后转化到E. coli Top10感受态细胞中，培养10 h;使用M13-F：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′和M13-R：5′- CAGGAAACAGCTATGAC-3′筛选阳性克隆，送往上海生工（生物工程股份有限公司）测序。
　　测序结果使用MEGA 5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件进行拼接[22]，并进一步在GenBank中使用BLASTn进行比对分析，确定其序列来源。
　　1.4.3 质粒标准品构建
　　使用质粒提取试剂盒（EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，北京全式金生物技术有限公司）提取阳性克隆中的质粒，然后将质粒浓度分别稀释为102、103、104、105拷贝/μL的标准品。
　　1.5 多重PCR
　　1.5.1 引物浓度梯度筛选
　　PCR扩增反应体系为50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游多基因引物各1～2.0 μL，104拷贝/μL的混合质粒模板1 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，去离子水补至50 μL。
　　PCR扩增反应条件为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。
　　1.5.2 引物扩增灵敏度
　　分别以浓度为102、103、104、105拷贝/μL的混合质粒为模板，进行多重PCR扩增反应，考察多重PCR检测模板的灵敏度。
　　PCR扩增反应的反应体系为50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游多基因引物各2.0 μL，混合質粒模板1 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，去离子水补至50 μL。
　　PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性4 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。
　　1.5.3 多重PCR检测蚜虫样品中共生菌的感染情况
　　分别以单独感染沃尔巴克氏菌的禾谷缢管蚜的总DNA、单独感染杀雄菌属共生菌的禾谷缢管蚜的总DNA、单独感染蚜虫U型共生菌的麦长管蚜的总DNA和未感染共生菌的麦长管蚜的总DNA为模板，判断多重PCR反应体系对蚜虫共生菌感染检测的效果。
　　2 结果与分析
　　2.1 常规PCR结果
　　如图1中1～6泳道所示，3种共生菌在单引物扩增时均未出现非特异扩增条带，说明引物具有较高的特异性;而且引物浓度对单引物扩增结果影响不大。将克隆测序结果在GenBank中进行BLASTn比对分析，结果显示其最相似的序列均为相关蚜虫共生菌的序列，进一步确定了常规PCR扩增结果的准确性。 　　2.2 多重PCR結果
　　如图1中7～8泳道所示，多重引物对组在扩增时均未出现非特异扩增条带，具有较高的特异性，而且引物浓度为0.4 μmol/L相对于0.2 μmol/L有较好的扩增效果。如图1中泳道10～13所示，本研究设计的多重PCR反应体系最低可以检测到浓度为104 拷贝/μL分别含有wsp基因、yaeT基因、gltA基因的混合质粒，具有较高的检测灵敏度。
　　进一步在蚜虫总DNA中验证了多重PCR扩增体系检测蚜虫样品中共生菌感染情况的可行性。结果（图2）显示，在感染共生菌的蚜虫样品中均扩增出了特异性条带，而在未感染蚜虫共生菌的样品中无扩增条带。而且扩增片段间长度差异都超过100 bp，普通的琼脂糖凝胶电泳就可以完全清楚分辨不同的扩增产物，从而直观地反映出待测的蚜虫样品中共生菌的感染情况。
　　3 结论与讨论
　　细菌是世界上种类最多，分布最广的一类微生物，研究发现仅在健康人体皮肤表面就分布有约1 000种细菌[23]，而昆虫作为物种多样性最丰富的动物类群，和细菌之间也具有密切的联系[24]。蚜虫，是较早开展共生菌研究的昆虫类群之一，早在20世纪60年代，研究者就通过显微镜观察到蚜虫体内具有多种形态的共生细菌[25]。近20年里，以细菌16S rRNA 基因作为主要的分子标记，研究者已经在蚜虫中鉴定了多种共生菌，它们分别属于不同的细菌类群，包括α变形菌纲[26-27]，γ变形菌纲[18-19]和柔膜菌纲[28]。在前期的研究中，研究人员基本上都是针对特定蚜虫共生菌合成特异的16S rRNA基因引物，使用常规PCR方法进行下游的共生菌检测和鉴定工作。在蚜虫共生菌相关的研究中，往往需要对多个样品和多种共生菌进行检测，使用常规PCR方法就显得耗时耗力。而利用多个引物组合构建的多重PCR体系已经广泛应用在环境微生物和致病微生物的高效检测和鉴定工作中。
　　本研究中，我们针对3种常见的蚜虫共生菌，沃尔巴克氏菌、杀雄菌属共生菌和蚜虫U型共生菌，分别选择在其相关研究中经常使用的3种蛋白质编码基因，wsp基因、yaeT基因和gltA基因作为目标基因进行了多重PCR扩增引物的设计，通过常规PCR扩增和克隆测序，确定了引物扩增的特异性和准确性，并进一步优化了多重PCR扩增体系。本研究中构建的多重PCR反应体系最低可以检测到的共生菌浓度为104拷贝/μL。而前期的研究发现，共生菌在蚜虫1龄若虫总DNA中的浓度就超过了108拷贝/μL[29-30]。因此，本研究设计的多重PCR反应体系具有较高的扩增灵敏度，完全可以满足在蚜虫样品中进行3种常见共生菌的检测，并大大降低了工作量，提升了工作效率，节省了相关的检测费用。本研究中，我们使用已建立的多重PCR反应体系，在禾谷缢管蚜和麦长管蚜样品中进行了共生菌的感染检测，结果显示，和常规检测结果一致，也并未出现非特异扩增，具有较高的共生菌感染检测特异性。但是，需要注意的是，由于不同蚜虫种类的遗传背景存在着差异，因此，建议在其他蚜虫种类中使用本研究建立的多重PCR反应体系时，先对扩增产物进行测序，确定序列来源，避免假阳性结果。另外，在将来的研究中，我们也将针对其他蚜虫共生菌，设计出可以和本研究多重PCR反应体系相兼容的检测系统，进一步简化蚜虫共生菌的检测和鉴定工作。
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　　（責任编辑： 田 喆）
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