赪桐叶中黄酮的提取及抗氧化活性的研究

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　　摘 要：本试验研究赪桐叶中总黄酮的提取工艺及体外抗氧化活性。在单因素试验基础上，采用L9（34）正交试验法优化其总黄酮提取的工艺，并测定赪桐叶的黄酮的抗氧化能力。结果表明：赪桐叶的黄酮提取最佳工艺为乙醇浓度80%，料液比1∶30（g/mL），提取时间20min，赪桐叶片总黄酮提取率为4.13%;在一定质量浓度范围内，黄酮总还原能力随着浓度的升高而增强，当黄酮浓度为1mg/mL时，黄酮对DPPH·和·OH的最大清除率分别为87.2%和86.5%，具有较强的抗氧化活性。
　　关键词：赪桐叶;黄酮;提取工艺;抗氧化活性
　　中图分类号：S-3
　　 文献标识码：A
　　
　　赪桐（Clerodendrum japonicum（Thunb.）sweet），又称百日红、贞桐花、状元红、荷苞花和红花倒血莲，为马鞭草科赪桐属多年生植物，花艳丽如火，花期长[1]。在我国主要分布于广东、广西、贵州及台湾等地，国外主要分布于日本、印度、马来西亚等地区和国家。赪桐的根、叶可入药，根具有祛风利湿，散瘀消肿的功效，用于治疗风湿骨痛，腰肌劳损，跌打损伤，肺结核咳嗽、咯血等;叶具有解毒排脓的功效，可外用治疗疮疖肿[2]。赪桐根含有鞣质、皂苷、黄酮类、酚类、香豆素与内酯、三萜类和挥发油等化学成分[3]。前期研究表明，赪桐根水提取物对急慢性炎症有抗炎的作用[4];通过对赪桐根中总黄酮的提取优化[5]，表明赪桐根含有一定黄酮成分。黄酮是一种强抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基[3]。
　　目前对于赪桐叶的化学成分及有效成分的分析还比较缺乏，为了深度挖掘赪桐的潜在药用价值，满足地方药用资源缺乏的迫切需要，本试验在前人研究的基础上，筛选赪桐叶片总黄酮提取的条件，测定黄酮含量及黄酮总还原能力，并测定其清除DPPH·和·OH的能力，系统评估其抗氧化活性，旨在为赪桐叶中黄酮成分的进一步研究与开发提供参考。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料与仪器
　　赪桐新鲜叶片：采摘于肇庆学院生物园，烘干粉碎备用。
　　芦丁、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、亚硝酸铝、磷酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、DPPH、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸等，试剂均为国产分析纯。
　　电子天平（FA2004A，上海精科）;真空泵（ZKJ-1型，上海）;超声波清洗器（KQ5100SD，昆山）;可见分光光度计（722型，上海精科）;干燥箱（ED-115型，上海一恒）等。
　　1.2 方法
　　1.2.1 工艺流程
　　赪桐叶片粉末→加入乙醇溶液→浸泡4h→超声波提取→减压抽滤→总黄酮提取液→进行含量测定及抗氧化活性测定及分析[5]。
　　1.2.2 单因素试验[6]
　　在维持其它条件不变的条件下，分别测定不同浸取液浓度（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶35，单位为g/mL）、提取时间（10min、20min、30min、40min、50min）各因素对黄酮含量提取的影响。
　　1.2.3 正交试验[7]
　　在单因素试验基础上，选取乙醇体积浓度、料液比、提取时间3个因素采用L9（34）正交试验法优化总黄酮提取的工艺，并根据优化条件进行验证试验。
　　1.2.4 赪桐总黄酮含量的测定
　　总黄酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法测定，精确称量10.0mg芦丁标准品于小烧杯中，用70%乙醇溶液溶解，并转移到50mL容量瓶中，定容至刻度，得到0.2mg/mL的芦丁标准液。
　　精密吸取标准液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL于25mL容量瓶中，各加水6mL，加入5%NaNO2溶液0.7mL，摇匀，静置6min;加5%Al（NO3）3溶液0.7mL，摇匀，静置6min;加1.0mol/L NaOH溶液5mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，静置6min。在510nm波长下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，芦丁质量浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。
　　精密吸取赪桐葉总黄酮提取液0.5mL至25mL容量瓶中，加水6.0mL，按上方方法显色后在510nm处测定其吸光度值，根据标准曲线回归方程和稀释倍数计算样品溶液中总黄酮含量。
　　1.3 赪桐叶片总黄酮的抗氧化活性
　　1.3.1 黄酮总还原能力的测定
　　取不同质量浓度（0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL）的赪桐叶片总黄酮提取液2.5mL，加pH6.6的磷酸缓冲液（0.2mol/L）2.5mL及1%铁氰化钾1mL，50℃水浴20min，加10%三氯乙酸2.5mL，3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL蒸馏水、0.5mL 0.1%三氯化铁，在波长700nm处测定其吸光度值[8]。
　　1.3.2 黄酮对DPPH·清除能力的测定
　　取不同质量浓度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的总黄酮提取液各1mL于刻度试管中，加入0.04mg/mL DPPH甲醇溶液5mL，25℃条件下避光静置60min，于517nm处测定吸光度Ax，以1mL 50%乙醇为空白测定吸光度A0，未加DPPH的样品溶液测定吸光度Ax0[9，10]。DPPH·清除率通过公式计算：
　　DPPH·清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%
　　1.3.3 黄酮对·OH清除能力的测定 　　取不同质量浓度（0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL）的总黄酮提取液各2mL于刻度试管中，再分别加入6mmol/L FeSO4、6mmol/L H2O2、6mmol/L水杨酸-乙醇溶液各2mL，将其放入37℃水浴锅中35min，待测液在波长510nm处测定吸光度Ax。以2mL去离子水为空白测得吸光度A0，未加入H2O2的溶液的吸光度为Ax0[11]。按以下公式计算·OH清除率：
　　·OH清除率/%=A0-（AX-AXO）A0×100%
　　2 结果与分析
　　2.1 芦丁标准曲线
　　经测定，由图1得出回归方程为Y=6.1339X+0.0045，R2=0.9994，在0～0.08mg/mL浓度范围内线性关系良好。
　　2.2 单因素试验
　　2.2.1 乙醇浓度对赪桐叶片总黄酮得率的影响
　　乙醇浓度对赪桐叶片黄酮提取液的影响见图2。由图2可知，赪桐叶总黄酮得率随着乙醇浓度增加呈先升高后下降的趋势，在乙醇浓度为70%时，总黄酮提取量最高达5.6%，乙醇浓度继续增加，其总黄酮得率逐渐下降，乙醇浓度为80%时，总黄酮得率为4.5%。根据相似相溶原理，赪桐叶总黄酮的极性与70%的乙醇溶液相近，在中等乙醇浓度溶液中溶解度较高，在高乙醇浓度溶液中溶解度较低。因此，赪桐叶片黄酮提取最适宜乙醇浓度为70%。
　　2.2.2 料液比对赪桐叶片总黄酮得率的影响
　　料液比对赪桐叶片黄酮得率的影响见图3。由图3可知，赪桐叶总黄酮得率随着液料比的增加而快速升高，当液料比达到1∶25（g/mL）时，总黄酮得率最高达3.7%，再增加液料比时，总黄酮提取量缓慢下降。液料比小，提取液中赪桐叶总黄酮过饱和，提取量降低。液料比增加，溶液与物料中的黄酮浓度差增大，由溶解平衡原理可知，黄酮提取量增加。但液料比过大，可能会改变提取液极性而降低部分黄酮成分的溶解性，再增加液料比时，总黄酮提取量缓慢下降。因此，赪桐叶片黄酮提取最佳料液比为1∶25（g/mL）。
　　2.2.3 超声提取时间对赪桐叶片总黄酮得率的影响
　　超声提取时间对赪桐叶片黄酮得率的影响见图4。由图4可知，赪桐叶总黄酮得率先随提取时间的增长而升高，提取20min时总黄酮得率最高达2.6%，此后总黄酮提取量缓慢下降，但总体差异不明显。因此，20min为适宜提取时间。
　　2.3 正交试验结果及分析
　　本正交试验以赪桐叶片黄酮得率为结果的评价指标[2]。其中，所提取黄酮的得率受乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声提取时间（C）3个因素的交叉影响。正交试验结果见表2。
　　从以上正交试验结果对比计算得出极差R值，极差差异最大的是料液比，说明料液比对赪桐叶片黄酮提取影响最显著，其次是提取时间;极差最小的是乙醇浓度，说明乙醇浓度对赪桐叶片黄酮提取的影响最小。对比3个因素，主次排序为B料液比>C提取时间>A乙醇浓度，超声辅助提取赪桐叶片黄酮的最佳条件为A3B3C2，即80%的浸取液浓度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取时间。
　　2.4 最佳提取条件的验证实验
　　在最佳组合条件下进行提取赪桐叶片总黄酮测定，结果见表3，所提取的黄酮得率为4.13%。3次平行测定得率均大于正交試验最佳组合所测得率3.94%，因此A3B3C2，即80%的乙醇浓度、1∶30（g/mL）的料液比、20min的提取时间为本试验的最优组合。
　　2.5 赪桐叶片总黄酮提取液的抗氧化活性分析
　　2.5.1 赪桐叶片总黄酮提取液的总还原力
　　如图5所示，试验采用Oyaizu法，通过观察添加不同浓度的黄酮提取液后Fe3+和Fe2+之间的转移来检测样品的还原能力，因为一种物质的还原能力与其潜在的抗氧化活性关系密切。黄酮提取液具有一定的总还原力，随着样品浓度的增加，吸光度增大，两者呈剂量依赖关系，吸光度越高，还原能力越强[12，13]。样品浓度（X）与吸光度（Y）间的回归方程为Y=3.8609X+0.1456，R2=0.9999。
　　2.5.2 赪桐叶片总黄酮提取液对DPPH·的清除作用
　　由图6可知，黄酮提取液对DPPH·有较强的清除作用，在质量浓度为0.125～1.00mg/mL范围内随着样品浓度的增加，清除率逐渐增加，并呈明显的量效关系，最大清除率为87.2%。
　　2.5.3 赪桐叶片总黄酮提取液对·OH的清除作用
　　在人体中，羟自由基是活性氧自由基的一种，因此测定总黄酮提取液对羟自由基清除率能反映出该物质的抗氧化活性能力[3]。由图7可见，赪桐叶片的总黄酮提取液对羟自由基的清除能力随着浓度升高而增强。当黄酮浓度为1mg/mL时，黄酮提取液对羟基自由基的清除率高达86.5%，证明其在体外抗活性氧基团的能力强，抗氧化活性表现较明显。
　　3 结论
　　上述研究可得知，浸取液浓度、料液比、浸取时间等因素对赪桐叶片黄酮的提取有一定的影响，且料液比影响较为显著。通过L9（34）正交试验法对赪桐叶片中黄酮的工艺流程参数进行优化。结果最优组合为乙醇浓度80%，料液比1∶30（g/mL），提取时间20min。最优组合下赪桐叶片总黄酮提取率达4.13%。秦祖杰[5]的研究表明赪桐根中含有总黄酮的含量为0.66%，两者比较表明，赪桐叶中的黄酮含量比根更为丰富。本研究所优化的提取工艺稳定、可行、提取率高。
　　针对于赪桐叶子黄酮的研究鲜有报道，这不仅不利于对中国传统中医药领域的研究，还不利于对中国自然资源的再利用。通过对赪桐叶黄酮的研究，测定赪桐叶黄酮的活性，有助于了解其成分功效，开发其潜在价值，研发出新的产品，将其工业化，扩大赪桐潜在市场，并以此带动传统农产品和中药材的附加价值再利用。 　　参考文献
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　　（责任编辑 贾灿）
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