全程氨氧化菌的发现及其进展研究

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　　摘 要：一百年以来，两段式硝化理论即氨氮先被氨氧化菌氧化为亚硝酸盐氮进而再被亚硝酸盐氧化菌氧化为硝酸盐氮得到了普遍认可。2015年，一种能够将氨氮在体内直接转化为硝态氮的全程氨氧化细菌（COMAMMOX）被人们发现，打破了传统的认知。现今，对COMAMMOX这种新的脱氮功能细菌已有较多的研究。对全程氨氧化作用的机理以及COMAMMOX细菌的发现、分布以及代谢特征进行了综述，结合现今的研究成果，也对COMAMMOX菌的工程应用提出了三个可能的应用方向：污水处理水厂出水的深度处理;减少N2O气体的排放;富营养化水体的修复。
　　关键词：硝化过程;硝化细菌;全程氨氧化细菌;氮循环
　　中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2020.02.094
　　
　　氮元素是组成蛋白质、维持生命体结构和功能的重要营养元素。氮的生物化学循环是生态系统物质循环的核心之一，主要是由微生物所驱动。其中，微生物参与的重要的氮循环环节有4个：固氮作用，硝化作用，反硝化作用和矿化作用。生物硝化作用是推动还原态氮（NH4+-N）向氧化态氮（NO2--N与NO3--N）转化的过程，是氮循环的关键过程，对维持氮素平衡具有重要的意义。俄国微生物学家Winogradsky于1890最早发现和分离了两种氨氧化微生物，并在此基础上提出NH4+-N的两步硝化理论：第一步由氨氧化菌（AOB）将NH4+-N氧化为NO2--N;第二步，由亚硝酸盐氧化菌（NOB）将NO2--N氧化为NO3--N。然而2004年，Venter等人在science上发表论文发现存在着氨氧化古菌（AOA）也能完成NH4+-N氧化为NO2--N的这一过程。
　　该理论一百多年来，受到了学术界的广泛认可。人们对硝化过程的研究多集中在氨氧化微生物上，这是因为：氨氧化一直被认为是硝化的限速步骤;AOA的发现引起了研究者们的关注并进行了大量的研究，如土壤以及水生系统等环境样品中的种群结构与分布;还有就是，NOB被认为中一种专性的化能自养细菌，生理特性较为单一。然而最近的研究发现，属于NOB的亚硝化螺菌属的部分微生物可以直接将NH4+-N在体内氧化为NO3--N，该微生物被称作为全程氨氧化微生物（COMAMMOX）。
　　COMAMMOX的发现以及其独特的完全氨氧化过程即能将NH4+-N直接氧化为NO3--N的微生物过程给传统的两步硝化理论造成了很大的冲击，引起了研究者关于硝化作用的诸多思考，如：由于COMAMMOX的存在，AOB以及NOB的生物活性是否被高估了？COMAMMOX对自然界NH4+-N氧化的贡献为多少？COMAMMOX在自然环境的生态位点是什么？了解COMAMMOX相关的以上问题对于正确认识生物硝化过程以及氮素的自然循环途径有着重要意义，本文将对全程氨氧化作用的机理以及COMAMMOX细菌的发现、分布以及代谢特征相关研究进展进行综述。
　　1 全程氨氧化作用与COMAMMOX细菌
　　传统的NH4+-N硝化过程是通过AOB以及NOB两种微生物先后催化完成的，如图1中的途径1所示。在第一步中，能够进行NH4+-N氧化作用的微生物还有AOA，在它们的氨单加氧酶（AMO）以及羟胺脱氢酶（HAO）参与下，NH4+-N被催化氧化成NO2--N;第二步中，在NOB中的亚硝盐氧化还原酶（NXR）参与下，NO2--N被催化氧化成NO3--N[14]。COMAMMOX菌中由于存在着氨氧化的全部的酶，能够发生将NH4+-N氧化为NO3--N的全程硝化过程。在热力学角度来说这个反应是完全可行的，如公式（1）和（2）所示：传统的硝化过程产生的标准吉布斯自由能变分别为ΔG°′=-274.7 kJ/mol和ΔG°′=-74.1 kJ/mol，而若一种微生物体内完成NH4+-N催化氧化成NO3--N的过程将获得更多的能量ΔG°′=-378.9 kJ/mol（如公式3所示）。所以理论上，能够实现全程氨化反应的COMAMMOX能从单位摩尔质量的NH4+-N中获得更多的能量，因此，Costa等人早在2006年就预测COMAMMOX在自然界中一定可以存在，COMAMMOX与AOB与NOB相比，生长速率可能较低。并且，我国学者郑平等人1999年就认为氧化NH4+-N这种基质产生的能量不高，理论上更利于一种微生物生长而不是两种微生物（AOB与NOB）。
　　2 COMAMMOX的发现
　　虽然科學家对完全氨氧化菌的存在一直深信不疑，但直到2015年11月，van Kessel等人《nature》发表了名为“Complete nitrification by a single microorganism”的文章，才正式的确认了自然界中有COMAMMOX菌的存在。van Kessel等人在一个水产养殖系统的厌氧滴滤池中取得生物样品，接种在厌氧反应器中并使用较低浓度的NH4+-N、NO2--N、NO3--N培养了12个月，得到了脱氮功能菌的富集物;这些富集物表现出了良好的厌氧氨氧化活性，即能在厌氧条件下将NH4+-N和NO2--N同时生成N2;通过原位荧光分子杂交技术（Fish）对富集物进行研究，发现富集物中存在45%的厌氧氨氧化菌，但还发现存在15%的疑似Nitrospira属的亚硝酸盐氧化菌;通过宏基因组测序发现，疑似Nitrospira属的亚硝酸盐氧化菌为两种 （Nitrospira sp.1 and sp.2），两种细菌细胞内均存在着NH4+-N氧化过程的相关酶AMO与HAO，以及NO2--N氧化过程相关的酶NXR，在基因水平上，Nitrospira sp.1 and sp.2均具有全程氨氧化潜力。为证明这一点，van Kessel等人用15N标记的NH4+-N来继续培养富集物，发现富集物中除了厌氧氨氧化菌生成的29N2，还有30N2的出现，这些30N2一定是Nitrospira sp.1 and sp.2将15N标记的NH4+-N氧化为15N标记的NO2--N，然后再由厌氧氨氧化代谢生成的。由此，就证实了原来是亚硝酸盐氧化菌的Nitrospira sp.1 and sp.2也有氨氧化的能力，是一种全程氨氧化微生物。 　　与此同时，Daims等人在俄罗斯北高加索的Aushiger地区的一个深约1200 m的石油勘探井的一段热水管上采集了生物膜样品，然后在46℃条件下用含NH4+-N的矿物培养基对生物膜进行培养，以得到高温氨氧化微生物;然而，在培养过程中发现了该培养物能够将氨氮完全氧化为硝酸盐;对培养物进行分离，最后得到了一种完全氨氧化微生物，Candidatus Nitrospira inopinata，它也含有与氨氧化过程相关的全部基因。这些關于COMAMMOX的发现，打破了传承100多年的传统硝化理论，使人们重新认识自然界的氮循环过程。
　　3 COMAMMOX在各生态系统中的分布
　　研究者发现COMAMMOX在自然生态系统中分布较为广泛。自然界中，COMAMMOX主要分布诸如森林土壤和水稻田等土壤环境，河流、湖泊和湿地等淡水环境以及它们的底泥和沉积物当中。然而，作为生命起源的海洋生态系统中，却尚未发现COMAMMOX的存在。
　　HU等人对来自中国各地的pH不同的300个土壤样品进行实时定量基因扩增荧光检测分析（qPCR），研究各土壤群落中COMAMMOX以及“半程氨氧化菌”AOB、AOA、NOB之间的相对丰度。结果表明，COMAMMOX在各土壤样品中广泛存在且数量众多，且在贫营养条件下比AOB、AOA、NOB更具有竞争力。万琪慧等人采集了重庆市北碚区冬水稻田5、10、20、40 cm深度处土壤样品，利用qPCR技术分析了土壤中“半程氨氧化菌”AOB、AOA、NOB和COMAMMOX在土壤中垂直方向上的丰度变化规律，研究结果表明：COMAMMOX在不同深度水稻土层中广泛存在，且数量远超“半程氨氧化菌”;并且发现COMAMMOX随着采样深度的增加丰度越来越高，这个结果也表明了COMAMMOX是一种可在贫营养条件下良好生长的微生物。
　　余晨笛等人从长江口潮滩沉积物中取得样品并进行了富集，发现富集物种有四类硝化菌群COMAMMOX、AOB、AOA以及NOB，其相对丰度分别为48%，50%，2%和0.1%，证明了长江口潮滩中存在着大量的COMMAMOX菌群;利用宏基因组转录技术分析四类硝化细菌的基因表达，结果表明COMAMMOX的基因表达活性最强，具有很高的代谢活性;又利用qPCR技术分析河口沉积物，湖泊以及河流沉积中COMAMMOX的群落多样性，最终发现河口，潮滩以及近海的COMAMMOX群落组成将近，而不同于湖泊，河流等沉积物的COMAMMOX群落。
　　在人工强化的生态系统，例如污水处理厂中也发现了COMAMMOX的存在。Daims等人研究指出在维也纳的污水处理系统中的COMAMMOX菌占到了全部硝化螺菌数量的73%-71%，比传统的AOB相比，也有较高的丰度。Chao等人从香港某好氧污水处理设施中取样并通过宏基因组技术对其中的脱氮细菌进行分析，结果表明样品中存在两种amoA基因与已发现的COMAMMOX菌Ca. N.inopinata的amoA基因的相似性分别可高达91%和90%，证明了该污水处理中存在着COMAMMOX，但相对丰度小于0.1%。Medini等人利用也利用宏基因组技术对来自美国、丹麦以及新加坡的6个污水处理厂生物脱氮设施中的16个样品进行了分析检测，发现均存在有COMAMMOX，且相对丰度在0.28%-0.64%之间。COMAMMOX在污水处理系统中广泛存在，但相对丰度不高，在脱氮过程中的作用需要进行进一步的研究和讨论。
　　4 COMAMMOX的代谢特征
　　尽管已经有大量的文献指出自然界和人工生态系统中存在着COMAMMOX，但对其代谢特征的研究还尚有不足。
　　在多数的自然环境中，NH4+-N的浓度较低，所以与氨氮氧化相关的三类微生物COMAMMOX、AOA以及AOB之间存在着竞争。有研究指出，AOA对氨氮的亲和能力远超过AOB，甚至可以在NH4+-N浓度极低的条件下仍可进行生长。但最近的研究发现，全程氨氧化菌可能具有比AOA更高的氨氮亲和能力。Dimitri等人经过4年的培养，富集了一株COMAMMOX菌株Nitrospira inopinata，对其进行动力学测试表明，该菌与传统的AOB菌群相比，具有更高的NH4+-N的亲和能力和表观产率系数，但氨氮氧化速率较低，故能在贫营养环境中进行缓慢的生长;对来自土壤和温泉中的四种AOA也进行了动力学测试并与Nitrospira inopinata相比较，发现AOA的NH4+-N亲和能力并没有COMAMMOX强，Nitrospira inopinata可能具有除从海洋分离出来的AOA 即Nitrosopumilus maritimus SCM1外最高的NH4+-N亲和能力。Nitrospira inopinata的高NH4+-N亲和能力以及低生长速率这些代谢特征，验证了COMAMMOX在低氨氮浓度的环境中更具有竞争力的结论。这也从生理代谢上为常常在氨氮底物贫瘠的土壤、水生环境中发现COMAMMOX提供了解释。
　　除对NH4+-N亲和能力高外，COMAMMOX也被证实具有多种代谢途径，它们可以吸收并降解尿素作为氮源，可以帮助其在氨氮浓度受限的环境中也能有足够的氮素来源;大多数COMAMMOX菌还可以利用H2和甲酸这类常见的厌氧发酵产物进行生长，这也有利于他们在厌氧以及缺氧的污水处理中生存。因此，需要对COMAMMOX菌的生理生态及其代谢特征进行更多的研究，可以帮助人们更加深入的理解地球氮循环，以及污水处理过程中的氮素转化，达到环境治理和保护的目的。
　　5 COMAMMOX菌的应用前景
　　目前，对COMAMMOX菌的了解不甚全面，需要继续研究他们的生化反应机理，以及除高氨氮亲和能力之外的其他的重要代谢特点，并且应该充分利用分子生物学技术手段研究COMAMMOX在常见或者重要的自然生态系统和人工生态系统中的分布以及对氮循环的贡献。目前，在诸多污水处理厂中均检测到了COMAMMOX的存在，然而研究者们常常认为其氮去除的贡献可以被忽略。但是，仍然不能忽略COMAMMOX在污水处理工程上所具有的脱氮潜力，经过研究可能可以应用在以下方面。 　　5.1 污水处理厂出水的深度处理
　　现今的城镇污水处理厂的二级出水中的NH4+-N虽然遵循国家拟定的《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A的8.0 mg/L限值的标准，但依然高于我国拟定的《地表水环境质量标准》V类收纳水体的限制值（2.0 mg/L），所以城镇污水处理厂的二级出水直接排放到地表水中，依然存在破坏环境的风险。所以，常常要采用多种方式对出水中的氨氮进行深度处理。COMAMMOX菌由于被证明具有比大多數AOB、AOA细菌都高的氨氮亲和力以及低生长速率的特点，使得其在贫营养环境具有较高的竞争能力，可以作为一种用于污水处理厂出水深度处理的氨氧化菌，达到保护环境的目的。
　　5.2 减少N2O气体的排放
　　传统硝化-反硝化脱氮工艺在将水中的氮以氮气形式排放的过程中，还会有N2O副产物的生成。N2O是一种温室气体，其温室效应约是CO2的300倍左右。以往的研究报道指出，低NH4+-N浓度时，AOA是主要的氨氧化细菌，会产生一定的N2O气体;在高NH4+-N浓度时，AOB是主要的氨氧化细菌，可能产生较多的N2O。COMAMMOX细菌是一种将氨氮直接氧化为硝态氮的功能细菌，可以大大减少N2O的排放。所以如果将COMAMMOX进行驯化并用于高含氮废水的处理，对减轻N2O的排放引起的温室效应具有重要的意义。
　　5.3 富营养水体的生态修复
　　近年来，地表水体的富营养化现象越来越普遍。造成水体富营养化的原因，便是向地表水体中排放的污水中含有氮磷等营养元素。水中的氮磷营养元素，使得水中的藻类物质进行大量的繁殖，引起水中的溶解氧急剧降低;水中的需氧生物由于得不到氧气的供应，而大量死亡，最后引起水体的恶化。当前，富营养水体的处理常常采用曝气的方式使得水体的溶解氧维持在一定的水平，水中的硝化细菌得以发挥作用将氮去除。如果将COMAMMOX菌作为一种生物强化菌剂，投入到富营养水体中，由于其NH4+-N亲和力高的特点，能够节省曝气能耗，达到低成本恢复富营养水体的目的。
　　6 结论
　　COMAMMOX菌的出现打破了百年来的两段硝化理论，对理解生物硝化以及氮循环有重要的意义。本文概述了全程氨氧化的特点以及综述了COMAMMOX的发现过程、在生态系统中的分布和代谢特征。发现现今对COMAMMOX的认识还相当的有限，仍有很多问题，如其的生化反应机理以及在其他生态系统中的分布需要进一步的研究。在COMAMMOX的工程应用前景上，我们根据COMAMMOX的特点，指出其可能存在以下三点的应用：（1）城镇污水处理厂二级出水的深度处理;（2）减少N2O温室气体的排放;（3）富营养化水体的修复。全程氨氧化作为一种新的氮循环途径，对其进行进一步研究，必将使得对地球氮循环以及人工强化脱氮的认识进行深刻;也可以会启发研究者，开阔思路，继而发现新的氮循环途径。
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