PD-L1和MMP2在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

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　　 【摘要】 目的：探討程序死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）在结直肠癌的表达及其临床意义。方法：收集2015年3月-2019年3月本院行根治手术治疗的结直肠癌患者86例的癌组织及癌旁组织标本，运用免疫组织化学方法检测癌组织及癌旁组织MMP2和PD-L1蛋白的表达水平，分析MMP2和PD-L1蛋白表达与结直肠癌临床病理学特征的关系。结果：MMP2和PD-L1蛋白均表达于目标细胞的细胞质和细胞膜。结直肠癌组织中MMP2和PD-L1蛋白表达阳性率均明显高于癌旁组织（P<0.05）。不同分化程度与pTNM分期的结直肠癌组织MMP2与PD-L1蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;且不同肿瘤最大径和CEA表达情况的结直肠癌组织MMP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。PD-L1和MMP2蛋白的阳性表达与结直肠癌具有相关性（rs=0.246，P=0.028）。结论：PD-L1和MMP2蛋白表达与结直肠癌组织具有相关性，其高表达率可能与结直肠癌发生发展有关。
　　 【关键词】 结直肠癌 细胞程序死亡配体1 基质金属蛋白酶-2
　　 Expressions of PD-L1 and MMP2 in Colorectal Cancer and Its Clinical Significances/YANG Dezhi， PAN Yunying， QIN Xingshan， CHEN Liuhong， HUANG Shuyuan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（13）： 019-023
　　 [Abstract] Objective： To investigate the expression of programmed death ligand 1 （PD-L1） and matrix metalloproteinase 2 （MMP2） in colorectal cancer and its clinical significance. Method： Cancer tissue and tissue adjacent to the tumour specimens were collected from 86 patients with colorectal cancer underwent radical surgical treatment in our hospital from March 2015 to March 2019. The expression of MMP2 and PD-L1 protein in cancer tissues and paracancer tissues were detected by immunohistochemistry. The relationship between the expression of MMP2 and PD-L1 and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer were analyzed. Result： MMP2 and PD-L1 were expressed in the cytoplasm and membrane of the target cell. The positive rates of MMP2 and PD-L1 protein expression in colorectal cancer tissue were significantly higher than those in tissue adjacent to the tumour （P<0.05）. The positive expression rates of MMP2 and PD-L1 proteins in colorectal cancer tissues with different differentiation degrees and pTNM stages were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. And the positive expression rate of MMP2 protein in colorectal cancer tissues with different tumor maximum diametral and CEA expression were compared， the differences were statistically significant （P<0.05）. The positive expression of PD-L1 and MMP2 were correlated with colorectal cancer （rs=0.246， P=0.028）. Conclusion： The expression of PD-L1 and MMP2 proteins is correlated with colorectal cancer tissues， and the high expression rate may be related to the development of colorectal cancer.
　　 [Key words] Coloretcal cancer Programmed death ligand 1 Matrix metalloproteinase-2
　　 First-author’s address： Traditional Chinese Medical Hospital of Liuzhou， Liuzhou 545001， China 　　 doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.13.005
　　 随着生活习惯方式等因素的改变，结直肠癌已经成为危害我国人民生命健康的主要肿瘤之一。然而特别令人遗憾的是结直肠癌的预后一直不佳，因此全国的相关研究人员长期从多方面努力寻求突破。值得关注的是近年来有科学家证实人体的免疫反应在肿瘤发生发展过程及多种治疗方式的反应中都具有至关重要的意义[1-2]。正常生理情况下，人体通过免疫负反馈方式调控炎症的合理反应程度，避免过度反应，从而达到保持健康的状态;而在病理情况下，狡猾的肿瘤细胞则能够通过模拟这些负反馈调控通路上的重要分子或促进机体表达这些重要分子来逃避免疫监视，从而促进肿瘤的生存和发展[3]。Bertucci等[4]研究表明，PD-L1在乳腺癌等多种肿瘤组织和免疫细胞中均可高表达。PD-L1可以通过与其配体PD-1相结合而发生作用，即形成所谓的PD-1/PD-L1调节通路。该通路能够通过调节T和B淋巴细胞的活化与增殖，来抑制免疫系统对肿瘤的攻击，即所谓的肿瘤免疫逃逸[5]。在机体中，阻断PD-1/PD-L1通路可恢复或增强T淋巴细胞功能，从而使肿瘤细胞被发现和被攻击，保持甚至增强机体正常的免疫监视和防御功能[6]。但是，PD-1/PD-L1通路具体通过何种下游通路的级联效应来实施肿瘤免疫逃逸功能尚不十分清楚。因此本研究期望通过检测结直肠癌和癌旁组织中PD-L1与MMP2蛋白表达情况，分析此两种蛋白阳性表达率与结直肠癌临床病理学特征之间是否具有相关性，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 样本来源 收集2015年3月-2019年3月于本院行根治手术治疗的86例结直肠腺癌患者的癌组织和癌旁组织标本。纳入标准：术前未接受化疗和放疗，术后常规组织病理学确诊为结直肠腺癌。排除标准：临床病理相关基本信息不完整者。其中男50例，女36例;年龄28岁～79岁，平均（62±12）岁，其中<60岁35例，≥60岁51例;肿瘤发生部位：结肠42例，直肠44例;肿瘤最大径：<5.0 cm 56例，≥5.0 cm 30例;组织学分化程度：高分化12例，中分化25例，低分化49例;pTNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期27例，Ⅲ期29例，Ⅳ期20例;淋巴结转移：有转移31例，无转移
　　55例;常见肿瘤标志物血生化检测：癌胚抗原（CEA）阳性40例，阴性46例;糖类抗原19-9（CA19-9）阳性15例，阴性71例。以上所有病理材料送检之前已与患者或代理人签订送检组织满足诊断后允许进行科研的同意书，并经本医院伦理委员会批准通过。
　　1.2 主要实验试剂 MMP2鼠抗人单克隆抗体（克隆号：Clone OTI4A11，货号：TA806846）、PD-L1鼠抗人单克隆抗体（克隆号：MRQ-22，货号：ZM-0381）和免疫组织化学二抗（SP法）试剂盒均购自中杉金桥（北京）生物公司。
　　1.3 方法 检测MMP2和PD-L1蛋白的表达。实验操作过程按免疫组织化学试剂盒说明书进行并且设立了标准的外部对照：常规制作4 μm厚石蜡切片，然后烤片脱蜡至水并抗原修复后，再滴加一抗冰箱孵育过夜，最后镜下观察滴加DAB显色、苏木素复染和封片。
　　1.4 判定标准 所有切片结果的判定由两位经验丰富的病理医师采用双盲法进行观察评估。PD-L1蛋白以细胞浆/质出现黄色或者棕色颗粒者为蛋白表达阳性，并结合阳性细胞所占比例，采用半定量积分法综合判定。（1）根据目标细胞的显色强度计分：无染色者记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。（2）目标细胞的占比：25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，≥76%记4分。PD-L1蛋白染色结果判断标准：目标细胞的染色强度和占比两项积分相乘，其中0～2分为表达阴性，≥3分为表达阳性[7]。MMP2蛋白以细胞膜和/或细胞浆成棕黄色或者黄褐色者染色为阳性染色细胞，然后高倍镜（200×）下评估阳性肿瘤细胞的面积与整张切片中肿瘤面积的比例，≥10%者为阳性，<10%者为阴性[8]。
　　1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;MMP2和PD-L1蛋白表达与结直肠癌组织的相关性分析采用Spearman秩相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 MMP2和PD-L1蛋白的阳性表达情况 MMP2
　　和PD-L1蛋白的免疫组织化学染色结果显示，两种蛋白均表达于目标细胞质和细胞膜，见图1。癌组织中MMP2和PD-L1蛋白表达阳性率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P<0.001），见表1。
　　2.2 结直肠癌组织中MMP2与PD-L1蛋白阳性表达与临床病理学特征的关系 不同分化程度与pTNM分期的结直肠癌组织MMP2与PD-L1蛋白阳性表达率比较，不同肿瘤最大径和CEA表达情况的结直肠癌组织MMP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　2.3 MMP2和PD-L1蛋白在结直肠癌组织中表达的相关性分析 PD-L1和MMP2蛋白在结直肠癌组织中同时表达阳性为43例。PD-L1和MMP2蛋白的阳性表达与结直肠癌具有相关性（rs=0.246，P=0.028）。
　　3 讨论
　　 随着肿瘤治疗的三大传统治疗方式（手术、放疗、化疗）技术水平的不断提高，患者的生存获益也得到了极大的提升，但是目前的治疗似乎也到达了一个新的“天花板”。值得期待的是近年来临床在肿瘤免疫治疗方面有了不小的新进展，特别是针对免疫检查点设计抑制剂的相关研究正迅速成为一种治疗恶性肿瘤极具前途的新方法[9]。有科研工作者已经证实能够通过抑制免疫检查点来恢复人体对肿瘤组织的免疫应答，从而有效的控制肿瘤[10]。运用相关原理和方法虽然在对晚期肿瘤的治疗方面获得了不小的突破，但是治疗的总体有效率仍然比较低[11]。例如在晚期肾癌治疗方面，有研究显示，针对PD-1/PD-L1通路的免疫检查点所设计的抑制剂，其有效率仅为25%[12]。但如果同时联合应用其他传统治疗药物则可提高治疗的有效率，这也反映了肿瘤免疫逃逸机制的复杂性[13]。因此，任何探究结直肠癌免疫监视与逃逸机制相关的研究均有可能為最终改善治疗甚至攻克该肿瘤做出贡献。 　　 PD-L1（亦称为B7-H1）是由中国学者于1999年率先报道[13]。PD-1包括PD-L1和PD-L2两种配体，其中PD-L1主要参与肿瘤的免疫调节方面。肿瘤组织自身能够产生PD-L1蛋白，该蛋白能与其在T淋巴细胞上的PD-1配体相结合，来引起T淋巴细胞对肿瘤的免疫监视功能障碍而不清除肿瘤，最终达到保护自身免受影响，实现免疫逃逸[14]。新近研究发现，PD-L1在包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌等多种肿瘤中均可高表达，且其表达水平的高低有助于判断肿瘤的侵袭和转移等生物学行为，同时也可作为判断预后的重要参考依据[15]。Uruga等[16]在关于肺腺癌淋巴结转移的研究中发现，PD-L1蛋白高表达与肿瘤的高pTNM分期、肿瘤的组织学类型、脉管侵犯等临床病理学特征密切相关，与本研究结果相似。本研究中，PD-L1虽然在结直肠癌及癌旁组织中均有表达，但癌组织中PD-L1蛋白阳性表达率为53.49%明显高于癌旁组织的22.09%（P<0.05），这提示PD-L1可能在结直肠癌的发生发展过程中可能起着重要作用。此外，本研究还发现，PD-L1表达阳性率与结直肠癌的分化程度和pTNM分期有关，即随着分化程度降低或pTNM分期升高PD-L1蛋白表达的阳性率反而越高，这亦提示PD-L1可能在结直肠癌的进展过程中也起着重要作用。总之，PD-L1蛋白结直肠癌组织中表达水平的高低可能帮助医生判断预后。
　　 MMP2（又名明胶酶A）目前已被很多学者证实在肿瘤组织中高表达，并且其在结直肠癌的发生发展中起重要作用。Han等[17]研究表明MMP2的表达水平与结肠癌的组织学分级和pTNM分期具有相关性。还有学者研究发现，IL-17A可能通过激活PI3K/AKT/NF-κB转导通路来调节MMP2蛋白的表达，从而诱导结肠癌SW480细胞迁移和侵袭力的提高[18]。
　　 本研究也有类似的发现，在结直肠癌组织中MMP2蛋白阳性表达率为73.25%高于癌旁组织的阳性表达率的30.23%（P<0.05），并且MMP2蛋白表达的阳性率与结直肠癌的组织学分化程度、pTNM分期、肿瘤最大径及CEA血生化阳性均具有相关性，这提示MMP2蛋白阳性表达率可能与结直肠癌的发生发展等生物学行为密切相关。本研究结果显示，PD-L1和MMP2蛋白阳性表达与结直肠癌组织具有相关性（rs=0.246，P=0.028），且两者阳性表达率均与肿瘤的分化程度和pTNM分期密切相关。这提示PD-L1和MMP2可能在结直肠癌的发生发展过程中存在协同作用。此外已有研究发现PD-L1与PD-1结合激活PI3K/AKT通路，亦有研究提示MMP2可被PI3K/AKT通路调控[19-20]。这些研究结果和本研究结果均提示，PD-L1可能通过PI3K/AKT通路和MMP2蛋白等因子发生相互作用来共同影响结直肠癌的发生和发展。
　　 综上所述，PD-L1和MMP2蛋白在结直肠癌组织中的异常高表达提示它们可能与结直肠癌的生长、侵袭、转移等密切相关。但是，它们之间的具体相互作用机制还有待进一步深入探究，也许在不久的将来在该通路上的一些重要因子会成为结直肠癌免疫治疗方面的新靶点也尚未可知。
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　　（收稿日期：2019-08-28） （本文编辑：田婧）
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