HPLC法测定银菊感冒胶囊中绿原酸的含量
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摘要：目的 建立银菊感冒胶囊中绿原酸含量测定的高效液相色谱法。方法 采用Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱;乙腈-0.4%磷酸溶液（9∶91）为流动相;流速：1.0 ml/min;检测波长：327 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μl;理论板数按绿原酸峰计算不低于1000。结果 绿原酸进样量在0.04348～0.39132 μg内线性关系良好，r=0.9997（n=6），平均回收率为98.66%，RSD=0.83%（n=5）。结论 本次建立的方法操作简便快捷，结果可靠，可用于银菊感冒胶囊中绿原酸的含量测定。
关键词：高效液相色谱法;银菊感冒胶囊;绿原酸;含量测定
中图分类号：R725.1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.09.052
文章编号：1006-1959（2020）09-0155-03
Determination of Chlorogenic Acid in Yinju Ganmao Capsules by HPLC
XUN Xiu-biao，WANG Yue-de
（Qujing City Food and Drug Inspection and Testing Center，Yunnan Province，Qujing 655000， Yunnan，China）
Abstract：Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the determination of chlorogenic acid in Yinju Ganmao capsules.Methods Hypersil ODS2 （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） chromatographic column; acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution （9∶91） as mobile phase; flow rate： 1.0 ml/min; detection wavelength： 327 nm; column temperature： 30 ℃ Injection volume： 10 μl; theoretical plate count is not less than 1000 based on chlorogenic acid peak calculation.Results The chlorogenic acid injection volume was in a linear relationship between 0.04348 and 0.39132 μg， r=0.9997（n=6）， the average recovery was 98.66%， and RSD=0.83%（n=5）.Conclusion The method established this time is simple and quick， and the results are reliable. It can be used for the determination of chlorogenic acid in Yinju Ganmao capsules.
Key words：High performance liquid chromatography;Yinju Ganmao capsules;Chlorogenic acid;Content determination
銀菊感冒胶囊为曲靖市中医医院的院内医院制剂（批准文号：滇ZJGF＼2005-538），由金银花、菊花、射干、氨基比林、马来酸氯苯那敏等组成，具有清热解毒、解热镇痛的作用。临床用于感冒、发热、头痛、咽喉肿痛等症。制剂质量标准中绿原酸仅有薄层色谱定性鉴别，无含量测定方法[1]。本文参考有关文献资料[1，2]，采用高效液相色谱法（HPLC）对该品种中金银花和菊花中总的绿原酸含量进行测定，旨在为银菊感冒胶囊质量控制提供依据。
1仪器与器材料
1.1仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）（四元泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器）;METTLE MS205DU电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;KQ-300UDB型双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;一体式超纯水仪（PURELAB Flex 3，英国ELGA公司）。
1.2药品与试剂 银菊感冒胶囊（批号190915、191017、191120，规格0.25 g/粒）样品均来自云南省曲靖市中医医院;绿原酸对照品（批号110753-2011817，含量96.8%）购于中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1对照品溶液制备 取绿原酸对照品10.87 mg，精密称定，置10 ml棕色容量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 ml置50 ml棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成含绿原酸21.74 μg/ml的对照品溶液，即得（10 ℃以下保存）。 2.1.2供试品溶液制备 取银菊感冒胶囊20粒，计算平均装量，取内容物，研细，混匀，取适量（约相当于绿原酸4 mg），精密称定，放入具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，密塞，超声处理（功率250 W，频率35 kHz） 30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3阴性样品溶液制备 根据制剂处方及工艺，配制缺金银花、菊花的阴性样品（由云南省曲靖中医医院提供），再按“2.1.2”项下方法制备，即得。
2.2色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Hypersil ODS2 5 μm，4.6 mm×250 mm;乙腈-0.4%磷酸溶液（9：91）为流动相;流速：1.0 ml/min;柱温：30 ℃;检测波长：327 nm;进样量：10 μl。理论板数按绿原酸峰计算不低于1000。
2.3方法学考察
2.3.1专属性试验 精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，按“2.2”项下色谱条件下，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。结果显示绿原酸色谱峰能有效进行分离，分离度大于1.5，理论板数按所测色谱峰计算大于1000，说明测定方法专属性较好，无干扰。
2.3.2线性关系试验 精密吸取“2.1.1”项下的对照品溶液各2、4、6、10、14、18 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算并绘制标准曲线，以对照品溶液进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），得回归曲线方程：y=30.04777+3.63056，r=0.9997（n=6）。表明进样量在0.04348～0.39132 μg线性关系良好。
2.3.3稳定性试验 取同一批次银菊感冒胶囊（批号190915）的同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h不同时间，按照“2.2”项下的色谱条件，进样测定，记录峰面积，结果峰面积RSD为1.52%（n=6）。结果表明供试品溶液在12 h内色谱峰面积变化不大，溶液较稳定。
2.3.4精密度试验 取银菊感冒胶囊（批号190915）按“2.1.2”项下方法制备的供试品溶液，精密吸取 10 μl，按照“2.2”项下的色谱条件进行分析，连续进样6次，记录绿原酸峰面积。结果绿原酸峰面积的RSD值为0.59%（n=6），表明仪器平行精密度良好。
2.3.5重复性试验 取同一批次的银菊感冒胶囊（批号190915）0.5 g，平行6份，精密称定，按“2.1.2”项下的方法操作，按照“2.2”项下的色谱条件进行分析，每1 g样品中含绿原酸7.10 mg，RSD为0.26%，结果表明该方法重复性良好。
2.3.6加样回收率试验 取已知含量的同一批银菊 感冒胶囊（批号190915，绿原酸含量7.10 mg/g）5份，每份约0.3 g，精密称定;另取绿原酸对照品25.15 mg，精密称定，置25 ml容量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取2 ml置已称定样品中，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行含量测定、计算回收率，见表1。平均回收率为98.66%，RSD值为0.83%（n=5）。表明本含量测定方法准确度良好。
2.3.7样品测定 取3个批次的银菊感冒胶囊（批号190915、191017、191120）分别按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，每批平行取样2份，按照“2.2”项下的色谱条件进行测定，每份测定2次，计算绿原酸含量，见表2。
3讨论
根据中国药典及相关文献报道[3]，同时通过实验，绿原酸在327.5 nm波长处有最大吸收，最终选用327 nm作为检测波长。有研究报道[4]，在试验 中曾采用流动相、50%甲醇、水、乙醇等溶媒超声 30 min进行提取，其中以50%甲醇作为提取溶剂为佳;再以50%甲醇为提取溶剂，对同一批号样品的超声时间进行考察，选择超声15、30、45、60 min后处理的样品溶液分别进行分析，结果各样品含量基本接近，故选择超声时间30 min处理样品。本试验采用3种流动相进行成分分离[5]：①乙腈-磷酸溶液;②甲醇-水;③甲醇-乙腈-水，结果发现乙腈-0.4%磷酸溶液（9∶91）为流动相保留时间合适且各成分获得较好的分离。因此可以采用高效液相色谱法测定银菊感冒胶中囊金银花与菊花的绿原酸的总量的方法来反映该制剂的内在质量。
综上所述，本试验中采用高效液相色谱法测定银菊感冒胶中囊金银花与菊花的绿原酸的总量，该方法操作简便，准确可靠，重复性好，可用于该制剂质量控制。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[S].北京：中國医药科技出版社，2015：221，310-311.
[2]王锦，马善波，李龙，等.提高咽炎颗粒的质量标准研究[J].西北药学杂志，2018，33（3）：51-54.
[3]左霞，刘春霞，杨金霞，等.HPLC法测定不同来源不同采收期忍冬藤和金银花中绿原酸含量[J].中国药师，2015（4）：158-160.
[4]李杨，邓刚，王豫梅，等.不同提取方法对金银花凉茶中绿原酸含量的影响[J].食品工业，2016（9）：115-118.
[5]屠万倩，刘晓苗，张留记，等.HPLC法同时测定不同产地不同品种菊花中8种成分的含量[J].中药材，2018，41（1）：152-155.
收稿日期：2020-01-14;修回日期：2020-01-21
编辑/成森
作者简介：荀秀彪（1968.7-），男，云南曲靖人，本科，副主任药师，主要从事食品、药品检验检测工作
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