加米霉素对牛呼吸道疾病相关病原菌临床分离株的体外药敏试验

来源:用户上传      作者:

　　摘要[目的] 对临床上分离病原菌的药敏试验结果进行分析，为临床用药提供依据。[方法] 采用微量肉汤稀释法，测定了加米霉素对牛场分离出的100株牛呼吸道疾病相关病原菌的最小抗菌浓度（MIC）。[结果] 加米霉素对临床分离的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体和链球菌均有良好的体外抗菌活性。[结论]临床上可用加米霉素制剂防治牛呼吸道疾病。
　　关键词 加米霉素;牛呼吸道疾病;微量肉汤稀释法
　　中图分类号 S856.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）02-0113-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.030
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Drug Sensitivity Test of Gammamycin on Clinical Isolates of Pathogens Related to Bovine Respiratory Diseases in vivo
　　ZHOU De-gang1，LU Ji-zhong2，LI Peng-peng1 et al
　　（ 1.Luoyang Huizhong Veterinary Medicine Co.， Ltd.， Luoyang， Henan 471000;2.Xinyang Animal Disease Prevention and Control Center， Xinyang，Henan 464000）
　　Abstract [Objective]To analyze the drug susceptibility test results of clinical pathogen，and provide the basis for clinical medication.[Method]The minimal inhibitory concentrations （MICs） of 100 strains of isolated pathogens related to bovine respiratory diseases from cattle farm with gamamine were determined using the standard broth microdilution method.[Result]The results of drug sensitive tests showed that gmimycin had good antimicrobial activity to clinical isolates of Pasteurella multocida， Mannheimia haemolytica， M. bovis and Streptococcus sp..[Conclusion]Gamithromycin preparation can be used to treatment bovine respiratory diseases.
　　Key words Gamithromycin;Bovine respiratory disease;Standard broth microdilution method
　　牛呼吸道疾病（BRD）是由病毒或细菌单独或混合感染引起的肺炎、支气管炎的通称，是一种世界范围内危害养牛业健康发展的重要疾病。该病具有发病率高、死亡率高和经济损失严重等特点[1-2]，针对该病，国内外尚缺乏有效的疫苗预防，仍主要依靠抗菌药物来防治。加米霉素应用于溶血性巴斯德杆菌、败血型巴斯德杆菌、嗜组织菌以及丝状支原体导致的牛呼吸系统疾病临床治疗[3-4]，在牛呼吸道感染性疾病防治中具有廣阔的应用前景。笔者对加米霉素进行牛呼吸道疾病相关病原菌临床分离株的体外药敏试验，旨在为将该药物用于防治牛呼吸道疾病提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验药物
　　1.1.1 受试药物。
　　加米霉素原料药，由洛阳惠中兽药有限公司提供，含量99.7%，批号20171001。
　　1.1.2 对照药物。
　　泰拉霉素，由洛阳惠中兽药有限公司提供，批号 PS150-1601002，含量100.00%;替米考星，由华北制药集团动物保健品有限公司提供，批号160502，含量96.20%;氟苯尼考，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号30823，含量99.00%，有效期为2017年8月;头孢噻呋，由华北制药集团动物保健品有限公司提供，批号160502，含量96.20%。
　　1.2 试验菌株
　　多杀性巴氏杆菌45株，溶血性曼氏杆菌25株，牛支原体10株，链球菌20株。所有菌株均为2015—2016年河北省唐山市奶牛场、四川省广安市肉牛场、四川省泸州市肉牛场的分离病原菌，大肠杆菌ATCC25922、金葡菌ATCC29213、牛支原体PG45为该试验所用的质控菌株，购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。
　　1.3 培养基
　　MH肉汤培养基，批号为150429，购自北京陆桥技术股份有限公司;MH琼脂培养基，批号为150626，购自北京陆桥技术股份有限公司;胎牛血清，批号为20141020，购自北京索莱宝科技有限公司;PPLO肉汤培养基，批号为3361447，购自BD公司;马血清批号为201511005，购自郑州益康生物工程有限公司;DMEM/LOW GLUCOSE培养基，批号为AAJ207748，购自HyClone公司。
　　1.4 药液配制 　　参照CLSI（2009年）标准[5-6]方法，配制终浓度为2 560 μg/mL的药物貯备液。过滤除菌，分装，于-20 ℃低温下保存备用。
　　1.5 细菌最小抗菌浓度（MIC）的测定
　　1.5.1 菌液制备。
　　将保存的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、链球菌等临床分离株分别接种于含10%胎牛血清的MH琼脂平板，在5%CO2、37 ℃恒温培养箱内培养18～24 h。分别挑取1～3个单菌落接种于含10%胎牛血清的MH肉汤，在含5%CO2、37 ℃的恒温培养箱内静置培养18～24 h，检测菌液OD值，当菌液浊度达到约5.0×108～7.5×108 CFU/mL时，将原菌液用液体培养基按1∶1 000稀释后保存备用。将质控菌株大肠杆菌ATCC25922、金葡菌ATCC29213分离株分别接种于MH琼脂平板，在37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，从各平板分别挑取1～3个单菌落接种于MH肉汤，在37 ℃恒温培养箱内静置培养12～16 h，检测菌液OD值，当菌液浊度达到5.0×108～7.5×108 CFU/mL时，将原菌液用液体培养基按1∶1 000稀释后保存备用。
　　1.5.2 MIC值测定。将药物贮备液用10%胎牛血清的MH肉汤培养基进行10倍稀释后获得浓度256 μg/mL的使用药液，然后再进行连续2倍稀释，将稀释后的药液各取100μL，依次加入到微孔板的第1～11孔，第12孔加100 μL不含药物的培养基作为阴性对照。分别吸取100 μL已制备的浊度5.0×108～7.5×108 CFU/mL的菌液分别加到微孔板的第1～11孔中，第12孔再次加入100 μL不含抗生素的肉汤培养基。多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌株、链球菌3种细菌的培养需在含5% CO2的条件下进行。每批试验均要求用标准菌株进行质控;每株菌针对一种药物的MIC值测定均需做2次重复。
　　1.5.3 MIC值判定。
　　在衬有黑底板的光线下观察，无细菌生长孔的最低药物浓度即为该药物的MIC值。
　　1.6 牛支原体最小抗菌浓度（MIC）的测定
　　1.6.1 支原体复苏。
　　将保存的支原体培养物取出充分融化后，吸取1 mL加入5 mL的PPLO肉汤培养基中，置于充有5% CO2 的37 ℃恒温培养箱中培养 2～3 d，待颜色变为橙色或黄色后，保存于4 ℃冰箱中待用。
　　1.6.2 支原体颜色变化单位（CCU）的测定。
　　将复苏的支原体原培养物用PPLO肉汤培养基（pH 7.6）进行10倍稀释，获得含支原体原培养物浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9。取无菌的96孔反应板，将稀释后的支原体培养物分别吸取200 μL加入第1～9孔中，在第10孔加入200 μL PPLO肉汤培养基作为阴性对照。置于含5% CO2 的37 ℃恒温培养箱中培养 2～3 d，直至颜色不再变化为至。记录出现颜色变化的最大稀释倍数，换算获得支原体原培养物的颜色变化单位（CCU）。将支原体原培养物稀释至104～105 CCU/mL，备用。
　　1.6.3 MIC值测定。
　　用PPLO肉汤培养基将药物贮备液稀释10倍，得到浓度256 μg/mL的使用药液，然后再用PPLO肉汤培养基对使用药液进行连续2倍稀释，将100 μL稀释后的药液按照浓度由高至低的顺序依次加入到微孔板的第1～9孔，第10孔加入100 μL PPLO肉汤培养基。在第1～10孔分别加入制备好的104～105 CFU/mL的支原体培养物100 μL。第10孔作为支原体生长对照;第11孔加入PPLO肉汤培养基200 μL作为阴性对照;将第12孔加入pH 6.8的PPLO肉汤培养基200 μL作为颜色对照。混匀后置于含5% CO2 的37 ℃培养恒温培养箱中培养 2～3 d，观察培养物的颜色变化并与颜色对照孔进行对比，将能抑制支原体生长（出现颜色变化）的最低药物浓度定义为MIC。每批试验均要使用牛支原体PG45参考菌株进行质控;每株菌针对一种药物的MIC值测定均需做2次重复，若2次重复的MIC值不一致则需进行第3次验证。
　　1.7 数据处理
　　分别记录每株临床分离菌对加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢噻呋的MIC值，计算各药物对每种临床分离菌的MIC50与MIC90。
　　2 结果与分析
　　2.1 多杀性巴氏杆菌的MIC检测结果
　　加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、头孢噻呋对多杀性巴氏杆菌临床分离株的MIC检测结果见表1。
　　由表1可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢噻呋对多杀性巴氏杆菌临床分离株（n=45）的MIC值分别为0.13～16.00 μg/mL、0.13～32.00 μg/mL、0.25～64.00 μg/mL、0.13～4.00 μg/mL和0.03～4.00 μg/mL。
　　计算各种药物对多杀性巴氏杆菌临床分离株的MIC50和MIC90，得出加米霉素的MIC50为1.00 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50为2.00 μg/mL，MIC90为8.00 μg/mL;替米考星的MIC50为2.00 μg/mL，MIC90为4.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50为0.50 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL;头孢噻呋的MIC50为0.13 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL。
　　2.2 溶血性曼氏杆菌的MIC检测结果
　　加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、头孢噻呋对溶血性曼氏菌临床分离株的MIC检测结果见表2。 　　由表2可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢噻呋对溶血性曼氏杆菌临床分离株（n=25）的MIC分别为0.25～2.00、0.50～4.00、4.00～16.00、0.50～2.00和0.50～4.00 μg/mL。
　　計算各种药物对溶血性曼氏杆菌的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50为0.50 μg/mL，MIC90为1.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50为2.00 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL;替米考星的MIC50为8.00 μg/mL，MIC90为8.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50为1.00 μg/mL，MIC90为1.00 μg/mL;头孢噻呋的MIC50为1.00 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL。
　　2.3 牛支原体的MIC检测结果
　　加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、头孢噻呋对牛支原体临床分离株的MIC检测结果见表3。
　　由表3可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢噻呋对牛支原体临床分离株（n=10）的MIC值分别为2.00～8.00、2.00～16.00、8.00～64.00、2.00～8.00和64.00～128.00 μg/mL。
　　计算各种药物对牛支原体临床分离株的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50为4.00 μg/mL，MIC90为8.00 μg/mL;泰拉霉素的MIC50为4.00 μg/mL，MIC90为16.00 μg/mL;替米考星的MIC50为16.00 μg/mL，MIC90为64.00 μg/mL;氟苯尼考的MIC50为4.00 μg/mL，MIC90为8.00 μg/mL;头孢噻呋的MIC50为128.00 μg/mL，MIC90为128.00 μg/mL。
　　2.4 链球菌的MIC检测结果
　　加米霉素、替米考星、泰拉菌素、氟苯尼考、头孢噻呋对链球菌临床分离株的MIC检测结果见表4。
　　由表4可知，加米霉素、泰拉霉素、替米考星、氟苯尼考、头孢噻呋对链球菌临床分离株（n=20）的MIC值分别为0.13～0.25、0.13～0.50、0.13～0.50、0.50～2.00和0.06～1.00 μg/mL。
　　计算各种药物对链球菌临床分离株的MIC50及MIC90，得出加米霉素的MIC50为0.25 μg/mL，MIC90为0.25 μg/mL;泰拉霉素的MIC50为0.25 μg/mL，MIC90为0.25 μg/mL;替米考星的MIC50为0.25 μg/mL，MIC90为0.50 μg/mL;氟苯尼考的MIC50为2.00 μg/mL，MIC90为2.00 μg/mL;头孢噻呋的MIC50为0.125 μg/mL，MIC90为0.50 μg/mL。
　　3 讨论
　　该试验结果表明，加米霉素对临床分离牛的多杀性巴氏菌体外抑杀作用与泰拉霉素、氟苯尼考、头孢噻呋相当，优于替米考星;对临床分离牛溶血性曼氏杆菌的体外抑杀作用与氟苯尼考相当，优于泰拉霉素、头孢噻呋、替米考星。对临床分离牛支原体的体外抑杀作用与泰拉霉素、氟苯尼考相当，优于替米考星;对临床分离的牛链球菌的体外抑杀作用与泰拉霉素、头孢噻呋、替米考星、氟苯尼考相当。Linhart等[7]报道，为评估加米霉素注射液和泰拉霉素注射液在控制牛呼吸道疾病感染控制效果，加米霉素注射液注射631头，泰拉霉素注射液注射621头，结果发现使用加米霉素注射液组由于呼吸道疾病引起的犊牛死亡率低于泰拉美素注射液组。Baggott等[8]选取 802 头处于 BRD 感染高危期的青年小牛进行对照试验，50%的牛按6 mg/kg采取皮下注射的方式给药加米霉素，其余50%的牛以盐水安慰剂注射作为对照，结果显示加米霉素治疗组的比率（86%）显著高于盐水治疗对照组（61%）。邓菲等[9]报道按推荐剂量（6 mg/kg）给 BRD 病牛单次皮下注射，给药 1 d后即可显著改善病牛发热、精神沉郁，呼吸困难等症状（P≤0.05），给药 4～5 d 后病牛即可恢复正常，治疗有效率可达 90%，牛呼吸道感染的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体等病原菌都能得到有效清除，与该研究体外药敏试验结果相似。Lechtenberg等[10]评估了加米霉素对纯种和杂种肉牛及非泌乳奶牛与牛支原体相关的牛呼吸系统疾病的疗效功能，结果表明加米霉素治疗组注射后 10 d 的治疗成功率为 68.5%，显著高于盐水对照组的成功率（12.8%），与该研究的体外药敏试验结果相近。
　　4 结论
　　加米霉素对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、支原体、链球菌等BRD相关病原菌均具有良好的体外抗菌活性，临床上可用加米霉素制剂防治牛呼吸道疾病。
　　参考文献
　　[1] 范颖，张继瑜，周绪正，等.牛呼吸道疾病的病原学与防制研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（1）：157-163.
　　[2] 韩猛立，康立超，钟发刚，等.细菌性牛呼吸道疾病的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40（5）：165-172.
　　[3] 罗显阳.加米霉素及其在牛呼吸系统疾病中的应用[J].广东畜牧兽医科技，2015，40（1）：12-15.
　　[4] 向蓉，杨大伟，岳磊，等.兽用抗生素加米霉素研究进展[J].广东农业科学，2015（16）：79-83.
　　[5] 中华检验医学杂志 CLSI临床检验标准编译小组.需氧菌的稀释法抗菌药物敏感性试验——第九版：M07-A9[J].中华检验医学杂志，2012，32（2）：1-63.
　　[6] 刘玉庆，李璐璐，骆延波，等.EUCAST欧盟药敏试验标准[J].中国标准导报，2016（5）：60.
　　[7] LINHART R D，BRUMBAUGH G W.Control of bovine respiratory disease，with and without co-morbidity by otitis media，in dairy heifers comparing gamithromycin，tulathromycin，or no medication at a commercial development facility[J].Journal of dairy science，2019，102（6）：5501-5510.
　　[8] BAGGOTT D，CASARTELLI A，FRAISSE F，et al.Demonstration ofthe metaphylactic use of gamithromycin against bacterial pathogens associated with bovine respiratory disease in a multicentre farm trial[J].Veterinary record，2011，168（9）：241-245.
　　[9] 邓菲，孙进，王红霄.加米霉素注射液治疗牛呼吸系统疾病（BRD）的田间试验[J].中国兽医杂志，2018，54（1）：105-109.
　　[10] LECHTENBERG K F，DANIELS C S，SCHIEBER T，et al.Field efficacy study of gamithromycin for the treatment of Bovine Respiratory Disease associatied with Mycoplasma bovis in beef and non-lactating dairy cattle[J].J Appl Res Vet Med，2011，9（3）：225-232.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15121846.htm