大晶帽石斛再生体系建立研究

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　　摘要    本文以成熟度70%原生大晶帽石斛荚果内种子为外植体，探究采用不同消毒时间、培养基成分构成及浓度配比对大晶帽石斛无菌萌发的影响。结果表明，大晶帽石斛荚果用5%次氯酸钠消毒15 min，可有效降低污染率;将消毒后荚果种子接入MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号2 g/L+0.1%活性炭+ 0.58%琼脂+2%蔗糖培养基中，种子萌发率达88%，是适宜大晶帽石斛无菌萌发的培养基配方。
　　关键词    大晶帽石斛;种子;无菌萌发;培养基;消毒时间
　　中图分类号    Q813.1+2        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）09-0141-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    In this paper，the pods with maturity of 70% of Dendrobium macrocephalum was used as explants to study the effects of disinfection time，different composition and concentration of medium on the aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.The results showed that disinfect pods with 5% sodium hypochlorite for 15 minutes could effectively reduce the pollution rate after inoculation.The seeds from the sterilized pod were inserted into the medium of MS+2 g/L peptone+0.5 mg/L NAA+2 g/L Huabao No.1+0.1% active charcoal+0.58% agar+2% sucrose，the seed germination rate could reach 88%.This is a suitable medium formula for aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.
　　Key words    Dendrobium macrocephalum;seed;aseptic germination;medium;disinfection time
　　石斛属（Dendrobium）为兰科（Orchidaceae）植物最大属之一，有1 500余种，在我国有80多种。石斛作为一种名贵中药材，在我国有悠久的应用历史。晶帽石斛（Dendrobium crystallinum Rchb. f.）主产于我国云南省，是一种喜湿、喜阴凉的多年生草本植物，多生长在温暖潮湿的热带亚热带深山老林的疏松树皮、树干上或石缝之中[1]。大晶帽石斛茎直立或斜立，不分枝，具多节，节间长3～4 cm，花朵形态优美，气味芬芳，花色明艳，具有很高的观赏价值，被誉为“四大观赏洋花”之一[2]。
　　由于石斛特殊的生物特性，种子无胚乳，大晶帽石斛自然繁殖能力低[3]。目前，对大晶帽石斛再生体系的研究较少。本试验采用成熟度70%野生大晶帽石斛荚果内种子作为外植体，研究不同成分构成培养基及添加物用量对大晶帽石斛种子萌发的影响，探讨荚果消毒时间对种子萌发的影响，旨在探究适合大晶帽石斛種子无菌萌发的条件，以期快速建立再生体系，为大晶帽石斛规模化生产提供理论指导依据和技术支持。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料
　　试验材料为云南文山野生大晶帽石斛荚果，采摘期为2017年12月至2018年1月，荚果皮整体呈绿色，部分泛黄，成熟度为70%[4]。荚果内种子呈绿色粘连块状。
　　1.2    试验设计
　　1.2.1    不同添加物对种子萌发的影响。共设4个处理，即添加NAA 0.5 mg/L+花宝1号2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L（A）、NAA 1.0 mg/L+花宝1号2.0 g/L（B）、花宝1号3.0 g/L（C）、蛋白胨3.0 g/L（D）。各个处理均加入MS+0.1%活性炭+琼脂0.58%+2%蔗糖，调制培养基的pH值为5.7。
　　1.2.2    不同消毒时间对种子萌发的影响。将预处理后的种子分别浸泡处理消毒8、10、12、15 min。
　　1.3    试验方法
　　1.3.1    荚果预处理。挑选健康无病、虫害少、颗粒饱满、色泽均匀的大晶帽石斛荚果，将荚果一端多余过长的果柄切除后置于洗衣粉水中漂洗5 min后，流水下冲滴20 min，再用纯水冲洗3～4遍后，置于超净工作台内备用。 　　1.3.2    接种。在超净工作台内，用75%酒精浸没荚果30 s，无菌水冲洗1～2遍，再用5%次氯酸钠分别浸泡处理消毒，而后用无菌水冲洗3～4遍，取已灭菌的培养皿，用无菌滤纸吸干荚果表面水分，用手术刀纵向剖开荚果外皮。由于种子成熟度较低，种子难以均匀抖落在培养基上，要用手术刀和镊子配合将种子从荚果内壁刮夹出来，再均匀接入培养基中。分别标注各组培养基以便后期观察记录和分析。
　　1.3.3    培养及观察。接种后的培养物放置在温度为（23±2）℃培养室的培养架上暗培养10～20 d[5]，待种子长出絮状组织后，逐渐转入光强为500～1 000 lx的正常光照下培养，光照时间为8～10 h/d，各组不同成分构成的培养基区分放置，每隔10 d观察并记录种子萌发情况和污染情况。
　　1.3.4    原球茎诱导增殖培养。接种60 d时大晶帽石斛种子萌发生长出原球茎，原球茎植株茂密嫩绿，可转接到新的培养基中进行增殖培养。试验中每团原球茎切割成较小的簇状，而后接入MS+蛋白胨2.0 g/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号2.0 g/L+0.1%活性炭+0.58%琼脂+2%蔗糖的培养基中，每个原球茎处理6瓶，培养40 d观察长势。
　　1.4    测定方法与指标
　　接种后需定期观察每个处理，分别记录大晶帽石斛种子的萌发情况和污染情况。根据定期记录的情况，统计种子萌发率，以种子生长出明显的絮状组织作为种子萌发的标志。相关计算公式如下：
　　萌发率/%=每组萌发种子粒数/每组接种种子粒数×100;
　　污染率/%=每组污染种子粒数/每组接种种子粒数×100。
　　2    结果与分析
　　2.1    不同成分构成培养基对大晶帽石斛无菌萌发的影响
　　由表1可知，4种不同成分构成的培养基都可以让大晶帽石斛种子在无菌条件下萌发，而且各处理之间差异明显。NAA、花宝1号和蛋白胨对大晶帽石斛种子在无菌条件下萌发均有明显影响。
　　2.1.1    NAA对大晶帽石斛种子无菌萌发的影响。由表1可知，添加了NAA的处理A、处理B培养基中大晶帽石斛种子的萌发率分别达到88%、72%，而没有添加NAA的处理 C、处理D的萌发率仅为28%、20%。接种20 d时4个处理种子均有不同程度萌发，而40～60 d，处理C完全停止生长并死亡，处理D生长缓慢。由此可见，NAA可以显著提高大晶帽石斛种子在无菌条件下的萌发率，生长期可以提供种子生长所需物质，但过高浓度的NAA在短时间内若不及时转接，则不利于增殖诱导。
　　2.1.2    花宝1号对大晶帽石斛种子无菌萌发的影响。一般来说，花宝1号成分主要有N、P、K，为大晶帽石斛种子无菌萌发过程中提供萌发所需物质。试验结果表明，加入花宝1号的处理A、处理B、处理C中种子在20 d的萌发率较处理D高，而未加入花宝1号处理D的大晶帽石斛萌发率最低，仅为16%。60 d时处理D与处理C相比，种子褐化程度较高。由此可见，花宝1号有促进大晶帽石斛种子无菌萌发的作用，并且可以抑制种子褐化现象产生。
　　2.1.3    蛋白胨对大晶帽石斛种子无菌萌发的影响。蛋白胨作为培养基的重要组成成分，主要提供给植物生长所需的有机碳源和氮源。当试验进行60 d时，缺少蛋白胨的处理B和处理C的种子生长不及处理A旺盛，但早期萌发时处理A种子萌发率与其他组区别不明显。由此可见，蛋白胨对大晶帽石斛种子无菌萌发影响较小，但具有为其生长提供养分的作用。
　　2.2    不同消毒时间对大晶帽石斛无菌萌发的影响
　　大晶帽石斛种子从接种到萌发所需时间为20 d左右，但是不同消毒时间处理的种子所需时间不一致。由表2可知，相同成熟度的种子进行不同消毒时间的处理，萌发率会出现显著差异。不同消毒时间处理对大晶帽石斛种子无菌萌发具有较明显的影响，这与俞婷婷等[1]研究结果相符。当次氯酸钠消毒时间最长为15 min时，污染率最低，为12%，萌发率最高，为88%，消毒效果最好;当消毒时间为12 min时，污染率升高为24%，萌发率降低为72%，消毒效果降低;当消毒时间为10 min时，污染率达60%，萌发率降低为28%，消毒效果不足;当消毒时间为8 min时，污染率最高，达80%，萌发率仅为20%。综上可知，大晶帽石斛种子最佳消毒时间在15 min内，随着消毒时间增加，消毒效果逐渐加强，由于大晶帽石斛荚果皮较厚，在没有破坏荚果皮的情况下，种子活性不会被影响。当大晶帽石斛荚果的消毒时间为15 min 时，可以有效降低大晶帽石斛种子接种后的污染率。
　　3    结论与讨论
　　3.1    外植体的选择
　　由于大晶帽石斛种子非常微小，胚多半不成熟或发育不全，无胚乳[6]。本试验中所使用外植体材料为成熟度70%原生大晶帽石斛荚果，荚果中种子由于成熟度不高，种子成块粘连，不能自然抖落呈粉末状，使得接种时种子必须成团接入培养基中，但当经过在适宜的诱导萌发培养基中培养20 d时，可以形成大量绿色原球茎。因此，大晶帽石斛种子无菌萌发时，可以选择成熟度在70%左右、顆粒饱满、无病虫害、色泽均匀的健康荚果作为外植体。
　　3.2    培养基成分构成
　　培养基成分构成的选择对种子的无菌萌发至关重要，构成和各成分用量不同的培养基对种子的无菌萌发影响各不相同[7-9]。汪红梅等[10]进行铁皮石斛种子无菌萌发试验时，使用MS改良培养基为基本培养基，添加2.0%土豆煮熟汁液、2.0%蔗糖、0.65%琼脂和0.1 mg/L NAA作为种子萌发培养基，培养基灭菌前pH值为5.7，种子能正常萌发，且萌发率达90%以上。姚志军等[11]进行齿瓣石斛种子无菌萌发试验时，选用花宝1号（N∶P∶K为7∶6∶19）3 g/L+LH（水解乳蛋白）1 g/L+蔗糖25 g/L，培养基pH值为5.8～6.2，能在40～45 d获得大量直径1 mm左右的原球茎。本试验中4个处理培养基种子均有萌发，但MS+花宝1号3 g/L+0.1%活性炭+0.58%琼脂+2%蔗糖培养基和MS+蛋白胨 3 g/L+0.1%活性炭+0.58%琼脂+2%蔗糖培养基中的种子在萌发絮状组织后迅速死亡，或者生长较缓慢。由此可知，过量添加蛋白胨和花宝1号不利于原球茎的诱导，即可说明这2种培养基均不适宜用作大晶帽石斛的无菌萌发。MS+花宝1号2 g/L+NAA 1 mg/L+0.1%活性炭+0.58%琼脂+2%蔗糖培养基能够顺利长出原球茎，当培养时间达60 d时，原球茎全部老化死亡，说明该培养基不适宜用于大晶帽石斛的无菌萌发。MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花宝1号2 g/L+0.1%活性炭+0.58%琼脂+2%蔗糖培养基中种子萌发率最高，全部生长出绿色原球茎，并且植株健康、色泽均匀，说明该培养基配置适合大晶帽石斛的无菌萌发[12]，适量的蛋白胨与花宝1号配合使用可以诱导原球茎增殖。 　　3.3    消毒时间选择
　　大晶帽石斛种子无菌萌发率受消毒时间的影响较大。在种子无菌萌发试验中消毒时间的选择要衡量灭菌彻底和保持种子生物活性。消毒时间过短，灭菌不彻底，种子的污染率极高;消毒时间过长，种子活性被破坏，导致种子死亡，萌发率低[13]。本试验表明，大晶帽石斛荚果在消毒15 min内污染率随消毒时间的增加而降低，死亡率无明显变化。可能是因为大晶帽石斛的荚果皮较厚，对荚果内种子保护较好，所以消毒时间为15 min未影响种子活性。综上所述，大晶帽石斛种子无菌萌发对成熟且未开裂的荚果进行15 min消毒比较适宜。
　　3.4    原球茎增殖
　　当大晶帽石斛经过25 d原球茎增殖增养后需要进行转接扩大繁殖。本试验在转接10 d后，原球茎没有出现增殖或死亡现象，说明培养基基本配比可以让原球茎继续生长，但生长速度较慢，可能是原球茎没有适应新生长环境，或是切割伤口的恢复所需时间较长。莫昭展等[14]在进行铁皮石斛原球茎的增殖研究表明，原球茎转接10 d后开始增殖，40 d时增殖速度达到最高，所得结论与本试验结果相符合。韩晓红等[15]的金线莲原球茎增殖试验表明，不同的基本培养基对原球茎增殖效率影响显著，其中B5培养基、MS培养基的增殖效率相对较高。本试验中添加0.1 mg/L NAA也能促进原球茎的增殖，但是效果不明显，增殖效率低。
　　3.5    活性炭影响
　　王平红[7]认为，在培养基中加入适量的活性炭，可以吸附具有抑制作用的化合物和植物激素。当植物生长素的含量大于细胞分裂素时，有利于种子萌发生根，还可以防止植物组织褐化、老化。有学者在进行安祖花人工种子的制备中添加了0.1%活性炭，不仅能够提高种子在无菌环境下的萌发率，还能有效抑制黄化和褐化。李树丽[9]认为活性炭用量超过2%会抑制生根。因此，本试验中所有培养基均添加0.1%活性炭，以促进种子萌发，防止褐化。
　　本试验通过比较不同培养基构成、不同添加物用量、不同消毒时间对大晶帽石斛种子无菌萌发的影响，旨在探究适合大晶帽石斛种子无菌萌发的条件，结果表明，在培养基中添加适量的NAA、花宝1号、活性炭和蛋白胨均对提高种子萌发率有帮助[16]。另外，用5%次氯酸钠对大晶帽石斛荚果消毒15 min，可以有效抑制接种后培养基的污染。然而，本试验内容还不够全面，一些有助于植物组织生根的营养物质可以在以后的试验中加入。试验中还发现一些问题，即添加NAA 0.5 mg/L+花寶1号2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L培养基中愈伤组织较多，影响生长和观察，原因可能是蛋白胨导致培养基中氮源过多，愈伤组织生长过旺;添加NAA 1.0 mg/L+花宝1号2.0 g/L培养基中种子会形成原球茎，之后原球茎迅速衰老死亡，其原因可能是NAA含量过高，NAA能促进细胞的分裂，添加1 mg/L NAA之后种子萌发迅速，但尚未及时转移到新培养基中，原球茎便会快速衰亡，因而应该掌握适宜时期，在长出原球茎后尽快转移进行增殖栽培，实现大晶帽石斛人工繁育产业化生产[17]。本试验在前人研究的基础上，进一步对大晶帽石斛种子的无菌萌发再生体系进行了研究，所得结论可以为大晶帽石斛的规模化生产提供一定的数据支持及参考。
　　4    参考文献
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