以Lorke法为基础的半致死剂量分析法在油酸和化香树果序及黄连素抗镉减毒评价中的应用

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　　摘要    镉污染严重威胁着农业的健康发展，如何有效抗镉减毒是保障农业生产安全的重要措施。然而，目前缺乏高效的抗镉药物及简便易行的评价方法。本试验借助Lorke法为基础的半致死剂量（LD50）分析方法，检测了油酸、化香树果序、黄连素等不同潜在的抗镉化合物的减毒作用。通过改良后的Lorke法测定不同抗镉药物对小鼠的经口镉LD50的影响。结果表明，与200 mg/kg VC相比，灌胃200 mg/kg油酸、化香树果序、黄连素能够减轻镉的毒性，提高镉的LD50。LD50由140～160 mg/kg分别上升至300～320 mg/kg（油酸组）、280～300 mg/kg（化香树果序组）和320～340 mg/kg（黄连素组）。以上结果表明，以Lorke法为基础的LD50分析方法，能够评价出油酸、化香树果序、黄连素的减镉毒作用及其剂量-效应关系。以上结果同时证明了相同剂量下黄连素效果要优于油酸、优于化香树果序。
　　关键词    镉毒性;油酸;黄连素;化香树果序;半致死剂量
　　中图分类号    S917.4        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）09-0202-02
　　Abstract    Cadmium pollution is a serious threat to the development of agriculture，control and reduction of cadmium is an important way to ensure the safe of agricultural production.However，effective methods for controlling and evaluating cadmium toxicity are not available currently.To effectively reduce the toxic and adverse effects caused by cadmium，the LD50 analysis method based on Lorke method was used to evaluate the attenuating effect of oleic acid，Platycarya strobilacea caryopsis and berberine on cadmium toxicity.The modified Lorke method was used to determine the effects of different anti-cadmium drugs on transoral cadmium LD50 in mice.The results showed that 200 mg/kg of oleic acid，P.strobilacea caryopsis and berberine could reduce the toxicity of cadmium and increase the LD50 of cadmium in mice compared with 200 mg/kg of vitamin C.Their LD50 of cadmium rose to 300-320 mg/kg，280-300 mg/kg and 320-340 mg/kg，respectively.The results indicated that the LD50 analysis based on Lorke method was feasible to evaluate the attenuating effect of oleic acid，P.strobilacea caryopsis and berberine on cadmium toxicity，as well as the relationship between dose and effect.The results also proved that the attenuating effect of berberine on cadmium toxicity was better than that of oleic acid and P.strobilacea at the same dose.
　　Key words    cadmium toxicity;oleic acid;berberine;Platycarya strobilacea caryopsis;median lethal dose
　　工業发展在推动农业生产的同时，也带来镉等极具破坏性的污染物[1-3]。镉严重损害作物生长，更严重损害动物肝肾功能，导致脏器损伤[4]，产生极强的毒副作用[5-6]。如何有效降低镉对畜牧业的影响是农业部门关注的重点问题[7]。
　　半致死剂量（LD50）作为评价毒物毒性的重要指标，在毒物毒性评价、联合用药安全性方面有着重要的应用价值。即使在不同毒物之间、不同动物之间，根据LD50同样能够评价出毒物的毒性强弱变化。然而，试验动物作为食品、药品评价中的“活天平”，在精确评价药物的毒性时，往往需要牺牲大量动物进行反复检测才能评价出毒性强弱。如常规的LD50测定试验通常需要小鼠70只左右[8]，霍恩氏（Horn）法需要40 只小鼠，孙瑞元改良的寇氏（Karbor）法一般也需30只左右的小鼠[9]，而使用试验动物最少的Lorke法仅需13只小鼠[10]。
　　本试验以使用试验动物最少的Lorke法为基础，并以本团队前期发现的油酸等抗镉化合物作为试验药物[11]，以期为降低镉污染的影响提供有益数据，并拓展以Lorke法为基础的LD50分析法在毒性评价中的应用。 　　1    材料与方法
　　1.1    试验动物及主要试剂
　　试验所用小鼠为SPF级昆明小鼠（约30 g），购于广东广州中医药大学试验动物中心。氯化镉（>99%，AR级）、油酸（AR级）、盐酸黄连素（>99%，CP级别）、VC（>99%，USP级）等，购于上海生物工程有限公司。
　　1.2    以Lorke法为基础的LD50急性毒性试验
　　1.2.1    LD50剂量范围试验。基于Lorke法[10]，将新购买的小鼠适应性饲养7 d后，随机分成3个不同的药物组和2个对照组，每个药物包含低、高2个剂量。每个药物组的小鼠给予灌胃30、100、300 mg/kg氯化镉，每个剂量3只小鼠。每个药物组18只小鼠，对照组为9只小鼠，每个剂量下分配3只小鼠作为重复试验，共72只，分组情况见表1。给药24 h内，统计小鼠死亡情况，计算LD50所在范围，并在该范围内依据Lorke法设定4个新的氯化镉剂量。
　　1.2.2    LD50测定试验。基于1.2.1试验结果，设立4个新的氯化镉剂量，每个剂量下随机分配1只小鼠。给药24 h内，统计小鼠死亡情况，并计算LD50。
　　2    结果与分析
　　2.1    LD50剂量范围初步测定
　　本文根据Lorke法进行急性毒性试验，在灌胃30、100、300 mg/kg氯化镉的同时，灌胃油酸、黄连素、化香树果序等潜在镉毒缓解药物。在给药24 h内，对小鼠进行观察，并统计死亡情况，结果见表2。可看出，对照组未给予镉毒缓解药物时，100 mg/kg镉致死率为2/3，300 mg/kg镉致死率为3/3，给予常规镉解毒剂200 mg/kg VC则能有效降低100 mg/kg镉的致死率。而给予100、200 mg/kg化香树果序和黄连素以及200 mg/kg油酸，同样也能显著降低100 mg/kg镉致死率。镉对小鼠的半致死剂量范围往高剂量偏移。为了进一步证实该结果，在30～100 mg/kg及100～300 mg/kg范围内各重新选定4个剂量进行试验。
　　2.2    LD50测定试验
　　基于2.1的结果，进一步探索在油酸、黄连素、化香树果序等潜在镉毒缓解药物下的镉半致死剂量LD50。结果如表3、4、5 所示。可以看出，对照组的镉经口半致死剂量在140～160 mg/kg之间。给予常规解毒剂200 mg/kg VC，其镉半致死剂量则上升至280～300 mg/kg。而给予100 mg/kg油酸后，镉半致死剂量上升至260～280 mg/kg;给予200 mg/kg油酸后，镉半致死剂量上升至300～320 mg/kg;给予其他集中镉毒缓解药物，镉半致死剂量均有不同程度的上升。在这几类潜在的镉毒缓解药物中，黄连素的缓解效果最优，给予200 mg/kg黄连素时，镉半致死剂量上升至320～340 mg/kg。
　　3    讨论
　　相对于霍恩氏法和孙瑞元改良的寇氏法，以Lorke法为基础的LD50分析方法能够方便快捷地探索出毒物半致死剂量区间，并且能够较准确地评价各联合用药的减毒效果。在第1次试验中，以镉的半致死剂量近似值100 mg/kg为中间值[12]，以1/3 LD50近似值30 mg/kg和3倍LD50 300mg/kg分别为毒性评价低值和高值进行分组，各组3只，这与改良的寇氏法的各组剂量按等比级数、各组动物数相等的原则基本相同，不仅确保了第1次试验较高的可信度，同时还能初步评价出该药物减毒（LD50<100 mg/kg）或增效（LD50>100 mg/kg）作用。并针对原Lorke法探索镉等毒物存在剂量跨度较大，导致半致死剂量精确度较低等问题[10]，细化二次试验所用剂量数，将原有的单一范围4个剂量扩展到2个范围8个剂量，可精确地反映出各抗鎘药物剂量-效应关系。同样考虑到尽可能减少动物使用数量及精确度，每组单一小鼠的分配原则还是能够提供许多重要的有益数据。
　　在灌胃氯化镉的同时，给予小鼠100～200 mg/kg的油酸、化香树果序、黄连素能够不同程度地降低镉的毒性，提高小鼠镉的半致死剂量。相对于由未灌胃任何抗镉药物的对照组，灌胃油酸组小鼠的镉半致死剂量由140～160 mg/kg升至 300～320 mg/kg，其原因可能是油酸有效降低了镉的蓄积及镉造成氧化胁迫，降低镉对小鼠的毒性效应[13]。而降低镉水平也被认为是有效抗镉减毒的重要方法[14]。灌胃化香树果序与黄连素同样能够降低镉造成的毒性效应，虽然目前尚未有报道证实两者具有抗镉作用，但化香树果序多糖被证实清除DPPH、超氧自由基、羟基自由基，具备显著的抗氧化能力[15];而黄连素也被证实能够降低脂质过氧化、蛋白氧化，具有强抗氧化活性[16]。结合结果及相关报道，证实了基于Lorke法评价油酸、化香树果序及黄连素抗镉减毒活性的方法具有一定的应用价值。
　　4   参考文献
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　　基金项目   国家自然科学基金（31701706）;广东省高等学校创新强校项目（GDOU2019040203）。
　　作者简介   房志家（1986-），男，湖南桂阳人，博士，讲师。研究方向：食品质量与安全。
　　*通信作者
　　收稿日期   2019-01-08
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