白水生姜组培脱毒及离体快繁体系建立研究

来源:用户上传      作者: 吴家丽 赵佐敏 艾勇 唐虹 牛力立 李怀情 鲍菊

　　摘 要：以白水生姜茎尖为材料进行组培脱毒及离体快繁体系建立研究，结果表明，姜块催芽并在40~45℃光照箱中热处理30 d，再结合微茎尖（0.1~0.3 mm）分生组织培养，能有效脱除白水生姜烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。以MS为基本培养基，添加6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L有利于茎尖诱导分化；最适试管苗增殖培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L，增殖系数达7倍，丛芽叶绿、壮，长势好；生根培养基以MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L为宜，生根率达100%，纤维根多。
　　关键词：白水生姜；组培脱毒；离体快繁
　　 生姜（Zingiber offcinale Rosc.）为姜科姜属多年生宿根草本植物，是集调味品、食品加工原料和药用为一体的一种多用蔬菜[1]。白水生姜是贵州安顺地方优良品种，其根茎肉质、肥厚、扁平、皮肉黄色，有浓郁芳香和辛辣味，具有耐贮藏、品质优、适应性强的特点，是安顺市药食兼用的经济作物之一。但由于常年以块茎进行无性繁殖，繁殖系数低[2，3]，且反复重茬种植，导致病菌、病毒极易通过种姜在体内积累，引起生姜种植区域病害盛行，造成种性退化，品质变劣，减产严重。采用热处理结合茎尖分生组织培养，可脱除生姜病菌病毒，进而建立种苗、种姜快繁体系，是防止病害和提高繁殖系数的有效技术措施[4]。笔者通过3 a来对白水生姜离体快繁试验研究，已建立脱毒试管苗快繁体系，进而生产脱毒种姜，为白水生姜的生产发展提供优质种源。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　 以安顺市白水生姜姜块为材料，于光照箱中催芽并进行热处理的茎尖为外植体。
　　1.2 试验方法
　　 ①茎尖分生组织热处理 精选块大、肉厚、皮色黄亮光滑、芽眼饱满、未腐烂和未受病虫为害的健壮白水姜块，在自来水下洗净泥土，用0.1％的高锰酸钾处理15 min，再用0.5%多菌灵浸泡2 h后捞出晾干，置于高温灭菌后的珍珠岩中进行恒温（28℃）催芽，相对湿度80%～85%。待姜芽萌动后，于40～45℃（8 h/d）高温下热处理1个月。
　　 ②外植体消毒灭菌 于光照箱中切取热处理后长2 cm左右的姜芽，在自来水下冲洗20～30 min后晾干，在超净工作台上用75%酒精处理30 s，然后再用3种灭菌剂对姜芽进行消毒处理，无菌水冲洗5次后置于无菌滤纸上，吸干水分备用。3种灭菌剂及处理时间分别为：10%次氯酸钠（NaClO）15 min；10%双氧水（H2O2）15 min； 0.1%升汞（HgCl2）8 min。
　　 ③外植体接种、培养 将灭菌的姜芽置于体视镜下剥取0.1～0.3 mm的茎尖分生组织，接种于以MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA、NAA、IBA和AC（活性炭）的诱导（1～16号）、增殖（17～25号）和生根（26～33号）培养基中进行各阶段的培养，培养基组合见表1。培养温度为25～30℃，光照2 000 lx，12～16 h/d，培养基pH值5.8～6.0。
　　2 结果与分析
　　2.1 茎尖分生组织脱毒效果
　　 2010年7月9日将在体视镜下剥离的茎尖分生组织诱导的生姜试管苗（54个样品），送至云南省农科院农业生物技术重点实验室采用酶联免疫吸附法对黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）进行检测，结果显示，54个样品均未检测到阳性，即未发现相应病毒，脱毒率达100%。
　　2.2 不同灭菌剂对外植体灭菌效果的影响
　　 表2显示，3种表面灭菌剂对茎尖外植体处理不同时间后，其污染率和褐化率明显不同，以10%NaClO处理15 min的灭菌效果最好，污染率和褐化率最低，分别为4.65%和2.33%；10%H2O2处理15 min的污染率和褐化率为11.57%和4.13%；0.1% HgCl2处理8 min的污染率和褐化率为21.36%和12.62%。
　　2.3 不同诱导培养基对外植体分化的影响
　　 表3显示，外植体接种80 d后，在所有培养基中均能分化不定芽，其中2，6，7和12号培养基中不定芽分化率最高为100%，以12号（MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L）培养基中分化的不定芽最多，为4.0个/株，且长势强；6，7号培养基不定芽长势中等，分化数分别为3.0个/株和3.5个/株；1和11号培养基不定芽分化率95%，分化数为2.0个/株和3.0个/株，长势一般；16号培养基分化率80%，不定芽分化数2.0个/株，长势一般。6-BA浓度为 2.0~3.0 mg/L时不定芽分化率较高，且质量较好，数量较多；而同等条件下，NAA浓度为0.02~0.1 mg/L时，对不定芽分化影响差异极小。
　　2.4 不同增殖培养基对试管苗繁殖系数的影响
　　 表4可见，试管苗接种于17～25号培养基中培养45 d后，丛生芽生长速率差别小，株高为4.5~
　　5.0 cm，增殖系数以 19号培养基（6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L）的最大，为7.0倍，丛芽叶绿、壮，长势好，根多而壮；其次为20号培养基（6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L）增殖系数为5.8倍，丛芽绿，长势中等，根多；增殖系数最低是22号（6-BA 4.0 mg/L+ NAA 0.05 mg/L）培养基为3.0倍，肉质根多。同时在NAA浓度0.03 mg/L时，随6-BA浓度加大，丛芽数量增多，当NAA浓度为0.05 mg/L和0.2 mg/L时丛芽增殖呈降低趋势，说明适宜的6-BA与NAA配比是丛芽增殖的关键。
　　2.5 不同生根培养基对试管苗生根的影响
　　 表5显示，试管苗接种于26～33号生根培养基中45 d后均能生根，生根率100%。随着NAA（0.05~0.50 mg/L）浓度加大，生根数增多，以32号（MS+NAA 0.50 mg/L+AC 0.5%）和33号培养基（MS+NAA 0.50 mg/L+IBA 0.5 mg/L）最多，均为15条/株，其试管苗根长8.0 cm、粗、多为纤维根；其次为30号培养基（MS+NAA0.1 mg/L），生根12条/株，根长7.5 cm、粗、肉质根多；最差为26号（MS+NAA 0.05 mg/L）和31号（MS+ IBA 0.5 mg/L）培养基，生根仅8条/株，根长分别为4.5 cm和7.6 cm，纤细。表明NAA诱导生根效果优于IBA，单独运用，以较高浓度（0.5 mg/L）NAA效果较好。最好的处理组合是NAA分别与AC或IBA组配，说明NAA与AC或IBA协同作用，有利于促进生姜试管苗生根。
　　3 小结
　　 ①在白水生姜离体快繁中，外植体表面灭菌是组培成功的关键。试验以10% NaClO处理15 min的灭菌效果最好，污染率和褐化率均为最低；而以0.1% HgCl2消毒8 min的效果最差，其原因可能是处理时间不当，且HgCl2易残留，建议选用NaClO作为外植体表面灭菌剂。
　　 ②不同浓度激素配比中，所有培养基组合均可分化不定芽、增殖和生根，以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L作为白水生姜分化培养基最佳，其茎尖分化率为100%，分化的不定芽数量多，长势强；以MS+ 6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.03 mg/L作为试管苗增殖培养基最好，增殖系数达7倍，丛芽叶绿，长势好，根多、壮；试管苗生根培养中以MS+NAA 0.5 mg/L+0.5% AC和MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L最有利于试管苗生根，可考虑2种培养基交替使用。

　　 ③白水生姜试管苗增殖培养过程中，也可分化出肉质根，此结论与雷开荣[5]的研究一致，因此在离体快繁中可考虑增殖与生根同培养，以降低培养成本，缩短培养时间，减少接种工作量。
　　参考文献
　　[1] 薛寒青.生姜芽尖组织培养技术的研究[J].安徽农业科学，2007，35（34）：11 037-11 038.
　　[2] 康立美，王万福，孙风纪，等.蔬菜高效栽培技术实用技术[M].北京：中国农业科技出版社，1994：270-284.
　　[3] 王教义，范国强，张平.姜脱毒组培技术研究[J].山东农业科学，1999（6）：7-9.
　　[4] 葛胜娟.生姜组培苗的培育及其生产应用[J].中国农学通报，2007，23（5）：75-78.
　　[5] 雷开荣.生姜组织培养中增殖与生根同步培养技术研究[J].中国种业，2006，23（5）：75-78.
　　Research on Baishui Ginger Tissue Detoxification and Establishment of in Vitro Propagation System
　　WU Jiali, ZHAO Zuomin, AI Yong, TANG Hong, NIU Lili, LI Huaiqing, BAO Ju
　　( Institute of Agricultural Sciences, Anshum, Guizhou 561000 )
　　Abstract: In order to investigate in vitro propagation of ginger detoxification and system building method, useing Baishui ginger stem tissue as material was studied. The results showed that tuber germination and light in the 40-45℃ heat treatment box 30 d, combined with micro-tip (0.1-0.3 mm) meristem culture, could effectively remove Baishui ginger TMV, CMV virus. By MS as basic medium supplemented with 6-BA 2.0 mg/L, NAA 0.1 mg/L help tip induced differentiation; to MS + 6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.03 mg/L as the optimal vitro proliferation medium, up to 7 times the multiplication coefficient, cluster shoots green, strong, growing well; to MS + NAA 0.1 mg/L + IBA 0.5 mg/L for rooting, rooting rate reached 100%, many fibrous roots.
　　Key words: White ginger; Detoxification; Vitro propagation

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